DNA重组

当双链DNA分子的一条链上产生切口时E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸从而使切口沿着DNA链移动用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: ...

当双链DNA分子的一条链上产生切口时E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸从而使切口沿着DNA链移动用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: ...

RFLP操作要点 　 　　一、 材料 　　基因组DNA(大于50kb分别来自不同的材料)。 　　二、设备 　　电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸 ，eppendorf管(0.5ml)若干。 　　三、试剂： 　　1、限制性内切酶(BamHⅠ EcoRⅠ HindⅢ XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。 　　2、5×TBE电泳缓冲液 ...

RFLP操作要点 　 　　一、 材料 　　基因组DNA(大于50kb分别来自不同的材料)。 　　二、设备 　　电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸 ，eppendorf管(0.5ml)若干。 　　三、试剂： 　　1、限制性内切酶(BamHⅠ EcoRⅠ HindⅢ XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。 　　2、5×TBE电泳缓冲液 ...

TA克隆常见问题分析及其解决方案 问 题 可能的原因 建 议 转化后无 克隆菌产生 转化过程有问题或感受态细胞失活 可通过转化pUC18/19等未切割的可用于抗性筛选的质粒，检测感受态细胞的转化效率和转化操作是否正确 插入对照DNA片段的阳性率低 10×快速连接缓冲 液稀释不当 提供的T4 连接酶缓冲液为十倍浓度，10μl 反应体积加1μl T4 连接酶缓冲液 连接反应存在问题 连接缓冲液只有低的 ...

DGGE，CGGE及TGGE三种方法是基于相同的原理而设计的突变检测方法，它仍均是根据DNA的解链特性而设计.对于同一定序列组成或的DNA片段来说，它具有恒定的解链温度(Tm)，但若其序列发生改变时，Tm值亦发生改变，在含有变性因素(变性剂， 高温)的凝胶半进行电泳，当其比链解开形成分叉时，电泳迁移的速度就会改变.Tm值 全要取决于DNA的碱基组成，序列中出现单碱基替换时，Tm亦发生改变，电泳迁移 ...

我们克隆基因的时候，往往可以通过一些途径（如pcrEST库或者文库筛选）得到基因的部分片段。然后通过3'race 和 5'race 方法往两端延伸。有时会出现无法延伸的状况，如果你超作没有失误的话，这时候很有可能是你模板GC含量过高的缘故，普通pcr 是没有办法延伸的，可以用扩高gc 含量模板的Taq酶和BUffer就可以成功。这是我克隆基因中获得的经验。 ...

我们克隆基因的时候，往往可以通过一些途径（如pcrEST库或者文库筛选）得到基因的部分片段。然后通过3'race 和 5'race 方法往两端延伸。有时会出现无法延伸的状况，如果你超作没有失误的话，这时候很有可能是你模板GC含量过高的缘故，普通pcr 是没有办法延伸的，可以用扩高gc 含量模板的Taq酶和BUffer就可以成功。这是我克隆基因中获得的经验。 ...

基因组DNA的提取概 述 　　基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部 从而达到提取的目的。在提取过程中染色体会发生机械断裂产生大小不 ...

1.取15ml研磨器，加入5ml血块，4-5ml溶血试剂，研磨至无凝块存在。转移 到50ml离心管中，2500rpm，10min。2.去上清，假溶血试剂清洗一遍，2500rpm，10min，至无红色存在。3.去上清，加1ml细胞裂解液，转移到离心管，加20mg/ml蛋白酶K1oml，56度3小时.4.每管加1ml平衡酚，混匀，6000rpm，10min.5.重复步骤4.6.取上清于2mlEP管，加 ...

1.取15ml研磨器，加入5ml血块，4-5ml溶血试剂，研磨至无凝块存在。转移 到50ml离心管中，2500rpm，10min。2.去上清，假溶血试剂清洗一遍，2500rpm，10min，至无红色存在。3.去上清，加1ml细胞裂解液，转移到离心管，加20mg/ml蛋白酶K1oml，56度3小时.4.每管加1ml平衡酚，混匀，6000rpm，10min.5.重复步骤4.6.取上清于2mlEP管，加 ...

酶切反应建议一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言 ...

酶切反应建议一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言 ...

分子杂交技术 　　互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。　　杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA也可以是细胞总DNA或总RNA。根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交 即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便 ...

几个小技巧：1：在做多个同类酶切反应预混液时，水要多加1-5微升(当然不能超过预混液总体积的5%)，以防止最后一管酶液不够的尴尬局面.2:记住所用酶的特性，不光体现BUFFER的选择上。也体现记住不同限制酶稳定性上。比如BamHI5小时内稳定（37度），而BglII16小时内都保留100%的活性；那么在用酶时，如果能反应16小时，就可以采用BamHI : BglII = 2:1的用量了(为了省钱) ...

1. 10ml菌液过夜培养至饱和（OD600值为2-3） 2. 离心沉降细胞（Sorvall中以2000rpm的速度），然后以冷的、等体积的无菌蒸馏水洗涤 3. 将细胞沉淀在200μl 裂解缓冲液中重悬浮，然后加入约300μl 玻璃珠和200μl的1：1苯酚：氯仿混和液 4. 漩涡摇匀1-2min 5. 加入200μl的 TE缓冲液，倒置混合6-10次。注意：从这步开始漩涡摇匀可能会剪切DNA 6 ...

一:生长期重要性无庸置疑比如外源DNA基因组整合时酵母通常选取OD600值为1-2左右.这是因为其时酵母分裂旺盛细胞核膜较易被攻入(处于有丝分裂的前几期);同理基因组DNA松散暴露电转入的外源DNA较易整合; 细胞生命力也较强. 多种因素组合使得转化率得以提高.二:将你的细胞洗干净些很多新手做细菌酵母电转效率不高的原因有时很简单.最后的细胞悬液中带有太多的离子导致电流太强.曾看见新手电转时电转杯中 ...

Transformation of Gram-Positive Bacteriaan adaptation from Chang D. Chassy B. Saunders J. Sowers A. 1992.Guide to Electroporation and Electrofusion Academic Press Inc. San Diego CA.Guiding principles: ...

1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。3、足够多的载体和插入片段是最重要的 。我认为也不一定，要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生线性化产物，不利于环化的。4、平端的连接对于离子浓度很敏感回收的时候多洗洗我做了几次都很顺的加PEG和扩大酶量22度2小时后4C ...

一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。 所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实 ...