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DNA标记

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自杀性质粒载体的构建

自杀性质粒载体完全可以自己构建,只要保证两点: 1.自杀性质粒载体不能在你的宿主菌里进行复制,也就是说载体上不能有能在宿主菌中复制的复制子; 2.要由筛选标记. 自杀性质粒载体不能在你的宿主菌里进行复制,否则会导致细菌染色体突变株的构建失败。但是在构建时,要注意以下方面: 1、在制备质粒载体和DNA插入片断时 2μg 5kb大小的线状DNA大约含有1.4poml/L5'末端磷酸。5&lsqu ...

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质粒与载体

一、质粒 绝大多数的生物都是以DNA 的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori origin of replication,或译为复制起点),使整个基因体得以复制。含有复制原的遗传物质称为replicon,我们姑且把它译为为复制体吧!原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。其中质 ...

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Map-Based Cloning(图位克隆技术)

Map-Based Cloning of KAM2 Map-based cloning of the KAM2 gene was performed essentially as described previously (Tamura et al. 2005). We used codominant cleaved amplified polymorphic sequence markers ( ...

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双酶切反应酶活性分析

同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer,以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓,因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲 ...

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基因克隆载体的功能及其特征

载体:携带外源DNA 进入宿主细胞的工具。 一、载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞。 2.为外源基因提供复制能力或整合能力。 3.为外源基因的扩增或表达提供条件。 二、载体应具备的条件 1.具有对受体细胞的可转移性。 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3.长度尽可能小,以提高其载装能力。 4.具有多种单一的酶切位点。 5.具有合适的选择性标记。 附图: ...

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用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞方法

下面的简单方案是Clhen等(1972)所用方法的变通方案,常用于成批制备感受态细菌,这些细菌可使每微克螺旋质粒DNA产生5x106-2x107个转化菌落,这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株,并且比方案I快速,重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃,但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。 1)从于37℃培养16-20小时 ...

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分子诊断技术原理

20世纪50年代Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型,标志着分子生物学作为一门独立学科的诞生,70年代以来,分子生物学已成为生命科学领域最具有活力的学科前沿。由于分子生物学理论和技术方法不断地被应用于临床,在疾病和预防、预测、诊断、疗效地评价等多方面发挥着愈来愈重要的作用。分子生物学与临床医学的广泛交叉和渗透,产生了一个崭新的学科方向—分子医学;70年代末,美国科学院院士 ...

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Large Scale Plasmid, Cosmid, BAC, PAC, and Fosmid DNA Isolation by a Cleared Lys

DNA Isolation by a Cleared Lysate Method Followed by Double Acetate Precipitation Version 3b - updated September 26 1999 The Most Recent Roe Lab Implementation (by Feng Chen Hau-Qin Pan and Fu Ying) A ...

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Uniplex PCR-based Sequencing

Uniplex PCR-based Sequencing Latest update 2-21-00 A.PCR Reactions: B.Processing PCR products: C.Alternative PCR Reaction Cleanup steps instead of passage through Sephadex G-50 usually not performe ...

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几种重要肿瘤标志物及其应用

影响因素 1.肿瘤标志物具有特异性和非特异性的双重特点。 2.各种肿瘤特性的不同,如肿瘤的分期、大小、定位、组织来源及转移趋向等的不同。 3.各种抗体的不同,如多克隆抗体、单克隆抗体、抗体决定簇和抗体亲和性等的不同。 4.各种检测系统的不同,如检测原理、标记物、实验条件、检测技术、检测仪器和检测敏感度等的不同。 5.检验人员的专业水平和技术经验、以及实验室条件和实验的可靠性等的差异。 ...

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DNA重组实验常见问题分析

TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些? 参考见解: TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。NEB公司的酶的活性很高,切出两条小带可能是因为出现星活性,可以试试把酶量减半。NEB的酶很多都是克隆的,所以纯度比较高。 应用磁性微球提取人全血基因组DNA,将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应,应用Taq1酶,但发现酶切后产生的是smier片断,即切碎的状态。不知 ...

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Agrobacterium growth and transformation

Growth and storage of Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101: resistant to gentamycin and rifampicin so add 25-50 ug/ml Gentamycin 10 ug/ ml rifampicin on plates or in liquid media for selection. GV3 ...

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分离基因的方法

在已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列的情况下,基因的制备方法主要可分为两大类:一类是基因化学合成法,一类是基因生物制备法。一般又可将基因生物制备法分为文库法、cDNA 文库法和PCR法等。 1 化学合成法。 就化学本质而言,基因是一段具有特定生物功能的核苷酸序列。如果知道了基因的分子结构,就可以进行基因的化学合成。有关DNA 的化学合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸酰胺 ...

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重组DNA技术与基因工程(组图)

重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 重组DNA技术(Recombinant DNA Technique)是人类根据需要选择目的基因(DNA片段)在体外与基因运载体重组,转移至另一细胞或生物体内,以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。 这一技术的发展和应用,关键在于限制酶的发现和应用。 一、限制酶 限制性内 ...

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基因诊断技术的质控指标

临床医生了解基因诊断质控指标的含义,对于合理地选择检测方法和正确地分析与解释结果有很大的价值。 1.灵敏度 简单地说,灵敏度就是检测的最小值。一般来说,我们希望某一种检测技术的敏感度越高越好。理想地,病原体分离培养时能从待测标本中找到一个细菌或一个病毒颗粒或其他任何一个病原体;免疫学检测时,能测出一个抗原或抗体分子,等等,但这些通常都很难做到。然而基因检测则能达到这个理想境界,但在临床实践中,我 ...

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关于Plasmid 制备的技术解答

1. 质粒制备的基本原理是什么? 答:做过分子生物学实验的大多数做抽提过质粒,但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。所以有必要做一个说明,能帮助您了解和解决实验过程中遇到的一些问题。制备质粒最常用的方式是碱裂解法。质粒被转化到细菌中,单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中,一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞;细菌用悬浮液(Solution I 内含RNase A)悬浮细胞,用SDS-NaOH ...

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DNA重组技术常用酶

限制性核酸内切酶 :识别DNA特定序列,切断DNA链 ; DNA聚合酶Ⅰ: 或Klenow 1、缺口平移制作标记DNA探针; 2、合成cDNA的第二链; 3、填补双链DNA3’凹端; 4、DNA序列分析耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶等) 聚合酶链反应(PCR); DNA连接酶: 连接两个DNA分子 ; 多核苷酸激酶 :催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化,制备末端标记探 ...

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DNA的限制性内切酶酶切分析

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一 ...

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分子克隆的常用工具酶(组图)

限制和修饰现象在上个世纪中期被人们所发现,到 2005年1月,已经发现4342 种限制酶和甲基化酶,其中限制酶有3681 种。限制性内切酶有特定的识别位点和切割位点,切割后可产生平末端或粘性末端。酶切有标准的反应体系,受末端长度的影响,有位点偏爱性,在极端非标准条件下会产生星星活性。通过酶切连接可以增减酶切位点,酶切位点在基因组中的分布是不均匀的。大肠杆菌有三种甲基化酶和三种依赖于甲基化的限制系统 ...

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