化学生物学实验技术

　　所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1.在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光 ...

内参照法　　在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。竞争法　　选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时 ...

基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞的RNA的绝对表达量。可以先从样本中抽提RNA，再标记RNA，然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同RNA的量。然而用于杂交的某个特定基因的RNA的量与在一个相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂，它取决于多种因素，包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。所以芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种RNA的相对 ...

1．总RNA的提取（Northern 杂交）2．第一链合成：(1)总RNA样品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O补至5μl。将管标号为1A2APC A等。PC为阳性对照。(2)混匀后稍离心。(3）70℃孵育3min，冰浴2min后稍离心。(4）准备dNTP mix (以5管为例 ) 每管 5管 ...

RNAi在基础研究领域和医学研究领域的应用，其基础是siRNA的基因沉默作用。目前在体内或体外RNAi中应用的siRNA主要有两类：RNA和DNA载体。1、 RNA（1）siRNA：化学合成或体外转录的方法得到~21nt的两段小RNA，经退火后形成~19个碱基互补，两边3? 端各有2个碱基突出的siRNA。目前此类siRNA应用最广泛。尤其是经过修饰后提高稳定性的siRNA仍可表现特异的基因沉默作 ...

1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：http://www.genesil.com/business/products/order2.htmhttp://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.htmlhttp://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.htmlhttp://design.dharma ...

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分 ...

转染方法原 理应 用特 点二乙氨乙基(DEAE)-右旋糖酐法带正电的DEAE-葡聚糖(dextran) 与带负电的核酸磷酸骨架相互作用形成复合物通过细胞内吞作用进入细胞瞬时转染相对简便结果可重复但对细胞有一定的毒副作用转染时需去除血清磷酸钙法磷酸钙-DNA 复合物吸附于细胞膜被细胞内吞稳定转染瞬时转染操作简便但重复性差不适用于原代细胞及某些培养细胞阳离子脂质体法带正电的脂质体与带负电的 ...

反义核酸技术(antisense technology) 主要包括反义RNA ( antisense RNA) 和反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) 可以通过多种机制快速、可预测地调节培养组织或细胞的基因表达用来快速、有效地测定基因功能。 RNA 干扰技术天然反义RNA 广泛存在于原核和真核细胞内 通过与靶基因形成RNA-RNA 或RNA-DNA 双螺旋 对基因功能 ...

　　对于一些实验室来说，如果现成的商品化芯片不能满足研究需要，而自行设计向厂家定做芯片也不能满足时间的需要时，就需要自制芯片。要成功的制作芯片，需要准备3大材料：准备固定在芯片上的生物分子样品、芯片片基和的制作芯片的仪器。研究目的不同，期望制作的芯片类型不同，制备芯片方法也不尽相同，以DNA芯片为例，基本上可分为两大类：一类是原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探针），适用于寡核苷酸；一类是预 ...

疾病诊断 　　基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比，它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测，无需机体免疫应答反应期，能及早诊断，待测样品用量小；能特异性检测病原微生物的亚型及变异；可帮助医生及患者从"系统、血管、组织和细胞层次（通常称之为'第二阶段医学'）"转变到"DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次（第三阶段医学 ...

点样法在多聚物的设计方面与原位合成技术相似。只是合成工作用传统的DNA、多肽合成仪或PCR扩增或体内克隆等方法完成。大量制备好的核酸探针、多肽、蛋白等生物大分子再用特殊的自动化微量点样装置将其以较高密度互不干扰地印点于经过特殊处理的玻片、尼龙膜、硝酸纤维素膜上，并使其与支持物牢固结合。支持物需预先经过特殊处理，例如多聚赖氨酸或氨基硅烷等。亦可用其它共价结合的方法将这些生物大分子牢牢地附着于支持物上 ...

　　仅就目前的发展情况，微点阵芯片主要包括DNA微点阵芯片（又称基因芯片?或DNA芯片）和蛋白或多肽微点阵芯片两种。不过相信，基于其它生物大分子特异性相互作用的生物芯片也会相继问世。所谓DNA微点阵芯片是指同时将大量的探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特异性对DNA样品的序列信息进行高效率的解读和分析，以用于基因表达谱的检测、突变筛查、DNA多肽性分析、DNA测序和基因组文库作图等 ...

原位合成适于制造寡核苷酸和寡肽微点阵芯片，具有合成速度快、相对成本低、便于规模化生产等优点。照相平板印刷技术是平板印刷技术与DNA和多肽固相化学合成技术相结合的产物，可以在预设位点按照预定的序列方便快捷地合成大量寡核苷酸或多肽分子。在生物芯片研制方面享有盛誉的美国Affymetrix公司运用该技术制造大规模集成的Genechip。原位合成后的寡核苷酸或多肽分子与玻片共价连接。它用预先制作的蔽光板和 ...

　　基因芯片的类型按分类方法不同可分为不同的类型 无机片基和有机合成物片基的基因芯片　 以基因芯片的片基或支持物的不同可以分为无机片基和有机合成物片基，前者主要有半导体硅片和玻璃片等，其上的探针主要以原位聚合的方法合成；后者主要有特定孔径的硝酸纤维膜和尼龙膜，其上的探针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到片基上。另有以聚丙烯膜支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位合成高密度探针序列。 原 ...

口服固体制剂进入体内后，均需经过溶出过程，才能透过生物膜被机体吸收。难溶性药物由于其溶出速度受溶解度的限制，影响了药物吸收，因此作用缓慢，生物利用度较低。根据Noyes－Whitney溶出速度方程，dc／dt＝Ｋ·Ｓ·Ｃ（dc／dt为药物溶出速度，Ｓ为药物表面积，Ｃ为溶解度），溶出速度随表面积的增加而增加。因此，提高药物的分散度，减小药物粒度，使比表面积增加，则可以加快药物的溶出速度，提高生物利用 ...

　　分子印章技术与打印原位合成在合成原理上相同，区别仅在于该技术利用预先制作的印章将特定的合成试剂以印章印刷的方式分配到支持物的特定区域。后续反应步骤类似与压电打印原位合成技术。分子印章类似于传统的印章，其表面依照阵列合成的要求制作成凹凸不平的平面，依此将不同的核酸或多肽合成试剂按印到芯片片基特定位点进而进行合成反应。选择适当的合成顺序、设计凹凸位点不同的印章即可在支持物上原位合成出位置和序列预定 ...

固体分散体是指高度分散于惰性载体中形成的以团体形式存在的分散体系。研究表明，用适当的载体材料制备固体分散体，可以改善药物的溶解性能，加快溶出速度，提高生物利用度，实现药物高效、速效、长效化；也可控制药物靶向释放。将药物加工成特定的剂型，用于增加药物稳定性，避免药物氧化、水解等。固体分散体出现以来的各种实际应用表明，固体分散体的研究对于制剂的生产和新药的开发具有重要的意义。将难溶性药物在水溶性载体中 ...

超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction， SCFE.)是一种新型的提取分离技术，它利用流体(溶剂)在临界点附近某区域(超临界区)内，与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动，这种流体可以单一的，也可以是复合的，添加适当的夹带剂可以大大增加其溶解性和选择性。利用这种超临界流体(SCF)作溶剂， ...

纳米（nanometer，nm）是一种长度单位，一纳米等于10亿分之一米、千分之一微米。从具体的物质说来，人们往往用"细如发丝"来形容纤细的东西，其实人的头发一般直径为20-50微米，并不细。单个细菌用肉眼看不出来，用显微镜测出直径为5微米，也不算细。极而言之，1纳米大体上相当于4个原子的直径。DNA链的直径就是一纳米左右。由于纳米材料表现出许多不同于传统材料的特殊性能，所以纳米科技被视为21世纪 ...