化学生物学实验技术

黏粒英文cosmid，指带有黏端位点(C0s)的质粒。黏粒是由人工构建的含有允DNA的COS序列和质粒复制子的载体。黏粒有4个特点：①具有兄噬菌体的特性。黏粒在克隆了外源DNA在体外包装成噬菌体颗粒后，可以感染宿主菌并在细菌内按照丸噬菌体DNA的方式环化起来。但黏粒载体不含有λ噬菌体的全部必要基因，因此不会使宿主菌裂解，无法形成子代噬菌体颗粒。②具有质粒的特性。黏粒具有质粒复制子，可在宿主菌内像质 ...

噬粒(phagemid或phasmid)是由质粒载体和单链噬菌体载体构建成的。它们既有质粒的复制起点，又有噬菌体的复制起点。因此，在大肠杆菌细胞里，可以按正常的双链质粒分子进行复制，生成双链DNA；当存在辅助噬菌体的条件时，在噬菌体基因Ⅱ蛋白质的作用下，又可像单链噬菌体M13一样按滚环模型复制出单链DNA，并在包装成噬菌体颗粒后释放出宿主细胞。最为常用的噬粒载体有pUC118和pUCll9。两者除 ...

当基因转入破坏生物体基因组内某个基因后，观察由此引起的表型变化，同样也可认识基因的功能，这是基因剔除(gene knock-out)。基因剔除是用DNA重组技术剔除或破坏生物体基因组内某一特定基因，而后观察由此引起的表型改变。这样，可以了解该基因的生物学功能。现以小鼠为例，先将待剔除的基因制成缺失突变型，在缺失的位置上插入一个选择基因如新霉素抗性基因(neo)，同时再接上另一个选择基因如胸苷激酶基 ...

噬菌体展示库(phage display library)的基本原理是将外源基因同丝状噬菌体fd或MB的外壳蛋白P8基因或P3基因融合后导入噬菌体基因组，表达产生的外源肽与外壳蛋白P8或P3形成融合蛋白，展示在噬菌体的表面。导入了各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源肽的噬菌体展示库。当用一个蛋白质去筛查一个噬菌体展示库时，就会选择性地同与其有相互作用的某个外源肽相结合，从而分离 ...

启动子是位于结构基因5，端上游的一段DNA序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。全酶是指酶蛋白及其辅酶构成的有功能的复合物。RNA，聚合酶的核心酶虽可合成RNA，但不能找到模板DNA上的转录起始位点，只有带σ因子的全酶才能专一地同启动子结合。RNA聚合酶沿着模板前进，直到终止子，转录产生一条RNA链。通常把基因转录起点前面即5’端的序列称为上游( ...

增强子(enhancer)指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列。增强子是通过启动子来增加转录的。有效的增强子可以位于基因的5’端，也可位于基因的3’端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的效应很明显，一般能使基因转录频率增加10～200倍，有的甚至可以高达上千倍。例如，人珠蛋白基因的表达水平在巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)增强子作用下可提高600～1 000倍。增强子的作 ...

弱化子(attenuator)是在研究大肠杆菌的色氨酸操纵子表达弱化现象中发现的。在trp mRNA 5，端trp正基因的起始密码前有一个长162 bp的DNA序列称为前导区，其中第123～150位核苷酸如果缺失，trp基因的表达水平可提高6倍。研究发现，当mRNA开始合成后，除非培养基中完全不含色氨酸，否则转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止trp基因转录。换句话 ...

基因转录有正调控和负调控之分。如细菌基因的负调控机制是当一种阻遏蛋白(repressor protein)结合在受调控的基因上时，基因不表达；而从靶基因上去除阻遏蛋白后，RNA聚合酶识别受调控基因的启动子，使基因得以表达，这是正调控。这种阻遏蛋白是反式作用因子。 转录因子(transcription factor)是起正调控作用的反式作用因子。转录因子是转录起始过程中RNA聚合酶所需的辅助因 ...

绝缘子(insul，tor)长约几百个核苷酸对，是通常位于启动子同正调控元件(增强子)或负调控因子(为异染色质)之间的一种调控序列。绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。 绝缘子的作用是有方向性的，这是在果蝇实验中发现的。果蝇(D．melanogaster)的黄色基因座y上插入转座子gypsy后，会造成有些组织中的y基 ...

沉默子(silencer)是参与基因表达负调控的一种元件，是在研究T淋巴细胞的T抗原受体(TCR)基因表达调控时发现的。TCR有α/β、γ/δ两种，编码α链和δ链是同一基因座的两个等位基因，α链恒定区Ca基因3’端下游的。增强子在各种T细胞中都有可能表达。因此，在T细胞分化时，需要通过各种正负调控机制进行精确的选择，方能正确地表达。已知有3个负调控元件，一个紧接在Ca基因的3’下游，另一个则在Co ...

亮氨酸拉链(leucine zipper)是由伸展的氨基酸组成，每7个氨基酸中的第7个氨基酸是亮氨酸，亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在。螺旋的一侧，所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧。当2个蛋白质分子平行排列时，亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成“拉链”。在“拉链”式的蛋白质分子中，亮氨酸以外带电荷的氨基酸形式同DNA结合。 原癌基因c—fos 的蛋白产物是磷酸化蛋白，有一个亮氨酸“拉链”区，却不 ...

应答元件(response element)是位于基因上游能被转录因子识别和结合，从而调控基因专一性表达的DNA序列，如热激应答元件(heat shock response element，HSE)、金属应答元件(metal response element，MRE)、糖皮质激素应答元件(glucor-ticoid response element，GRE)和血清应答元件(serum respon ...

螺旋—转角—螺旋(helix-turn-helix)是最初在久噬菌体的阻遏蛋白中发现的一种DNA结合结构域。在阻遏蛋白氨基端有5段 α 螺旋，每段螺旋之间折转成一定角度相连接，其中两段负责同DNA结合(图7—6)。。螺旋3由9个氨基酸组成，与前面的由7个氨基酸组成的。螺旋2形成一个角度。α螺旋3通过氨基酸侧链同DNA碱基之间的氢键同DNA序列相结合，3个氨基酸识别3个碱基，所以 α 螺旋3被称为识 ...

DNA结合蛋白的共同特性是具有一些与DNA结合的螺旋区，并能形成二聚体。螺旋—环—螺旋(helix-loop-helix，HLH)蛋白质具备上述两种特性，并都有一个共同的基序。基序由40～50个氨基酸组成，含有2个两亲的(amphipathic，既有极性基也有非极性基)。螺旋，由2个长度不等的连接区(环)相连。通过两条螺旋对应位置上的疏水性氨基酸残基之间的相互作用，可以生成同源二聚体或异源二聚体。 ...

同源域(homeodomain)是在同源异形基因(homeoticgene)中已提到的由180个核苷酸编码的60个氨基酸序列，这个肽段里的氨基酸组成在进化上是保守的，从果蝇、小鼠到人很少发生改变。编码同源域的180个核苷酸通常位于基因3’端的外显子中。同源域起着转录因子的作用。 果蝇中已鉴定出含同源域编码框(homeo box)的基因不少于40个，小鼠中也发现了20多个，其他如线虫、蛙和人中 ...

基因转录是以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚合酶的催化作用下，将4种核苷酸合成RNA。原核生物的RNA聚合酶的结构很相似。在真杆菌中只有一种，负责mRNA、tRNA和rRNA的合成。大肠杆菌RNA聚合酶由多个亚基组成，全酶(holoenzyme)是α2β'βσ，相对分子质量约480 000。口亚基同全酶的结合不紧密，很容易解离下来。除去σ因子后剩下的部分称为核心酶(α2ββ')。 利福霉 ...

卫星DNA(satellite DNA)是一类高度重复序列 DNA在介质氯化铯中作密度梯度离心，离心速度可以高达每分钟几万转；此时DNA分子将按其大小分布在离心管内不同密度的氯化铯介质中，小的分子处于上层，大的分子处于下层；从离心管外看，不同层面的DNA形成了不同的条带。根据荧光强度的分析，可以看到在一条主带以外还有一个或多个小的卫星带。这些在卫星带中的DNA即被称为卫星DNA，这种DNA的GC ...

重复序列家族(sequence family)是指一类核苷酸序列高度相似的重复序列，这些重复序列包括基因和基因以外的序列。真核生物基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因可归为一个基因家族(gene family)。基因家族也可归人重复序列，但并不是重复序列的主要组成。重复序列主要是基因以外的DNA序列。根据其在基因组中的组织形式，可分为串联重复序列和散在重复序列。这些复重序列的来源多半是R ...

与串联重复序列的组织形式不同的另一类重复序列是散在方式分布于基因组内的散在重复序列。这类DNA序列一般都是中度重复序列。根据重复序列的长度可以分为短分散重复序列(short interspersed nuclear elements，或short interspersed repeated sequences，SINEs)，长度在500 bp以下，在人基因组中的重复贝数达10万以上。重复序列单元长 ...

基因转录产生的mRNA分子中，由于核苷酸的缺失，插入或置换，基因转录物的序列不与基因编码序列互补，使翻译生成的蛋白质的氨基酸组成，不同于基因序列中的编码信息，这种现象称为RNA编辑。RNA编辑同基因的选择剪接或可变剪接(alternative splicing)一样，使得一个基因序列有可能产生几种不同的蛋白质，这可能是生物在长期进化过程中形成的、更经济有效地扩展原有遗传信息的机制。 RNA编 ...