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问： 大家好，我第一次作转染，是悬浮细胞， 已经在园子里看了好多这方面的资料，收获很大，可还是几个问题要问大家： 1）我打算用24孔板作转染，之后的筛选过程中肯定会有很多死细胞。这样小的体积（500μl），能不能作低速离心去死细胞呢？如果不能，要怎么去除死细胞呢？ 2）在96孔板每孔1个细胞的筛选的过程中，大家一般种多少孔进行筛选呢？ 3）96孔板筛选过程中，每个孔体积那么小要不要换液呢？需 ...

问：跟文献上的细胞一样，但跟他的质粒不一样，文献上说G418筛选浓度为500mg/ml，那我可以直接用这个浓度筛选我转染以后的浓度吗？质粒的不同对同一细胞的G418筛选浓度影响大吗？ 答： 由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。尽管文献上说特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的，但是由于实验 ...

问：我想用纸脂体转染法将质粒稳定转染入肿瘤细胞，请问可以选择哪种试剂盒？ 因为我不报销费用，所以想选一种即好用又较为便宜的，请求指点。谢谢 答：您的情况我们去年也曾遇到过。目前市面上的质粒提取试剂盒林林总总，令人难以取舍。我觉得首先应该根据自己的需要来选取。进口的试剂盒，比如qiagene，omiga，promega等固然好，但是价格较贵，如果自己的实验要求不是很高的话，用这些试剂盒感觉有浪费的嫌 ...

oldhappy求助：我做的是脂质体法转染（lipfectermine 2000）骨髓间充质干细胞（c57小鼠），现在刚转的是第3代细胞，铺板都很好，细胞密度也很大，但是36-48h观察基本没有荧光，也应该是没有转上了，宁外我的重组质粒时间很长了，提取有2个多月了，是不是这也有很大关系，以前的转染还算成功的/转染量如下。 A2.0重组质粒+50 培养基 B1.5脂质体+50 培养基 ...

问：最近要做萤光素酶载体PGL3转染细胞，PGL3载体上面带有neo的抗性标记，有一个老师和我说要培养基里面要加G418筛选，但我查了一些PGL3载体转染的文献，都没有提到加G418，所以想问问学长们到底要不要加G418？ 答：Neo是一个抗性基因，pGL3系列的载体上有这个抗性基因；Neo在原核（大肠杆菌）中表达的是Kan抗性；在真菌（链霉）中表达的是新霉素抗性；而在真核（细胞、酵母）中表达的则 ...

问：最近的一个实验困扰我许久，就是关于给药剂量的问题，具体如下： 我在培养瓶中按undefined10E6密度观察了心肌细胞的搏动和药物的干预情况，接下来想做MTT，需要用96孔板做，是否还需要保持原来的密度，或可以降到undefined10E5呢，希望高手指点， 答：1.给药剂量需要预实验摸索，可以用6孔或24孔板实验，按照倍比或10倍浓度梯度设计不同剂量组，观察药物量效关系，最终再选择合适的浓度或更合理的浓度梯度进行下一 ...

NIH3T3细胞中本身是没有TK的，1981年Scolnick利用lambda载体把胸腺嘧啶激酶（TK）转入NIH3T3细胞，构建成NIH3T3 TK细胞，所以细胞分为NIH3T3 TK＋和NIH3T3 TK-两种细胞，在Scolnick认为NIH3T3就是NIH3T3（TK－）。 他做转染细胞的基础是基于1969年Todaro的实验。 具体内容参看建株文献：J Virol.1981 Septem ...

问：目的蛋白7kd，筛了稳定株，可western检测不到，因为电泳时marker也跑得不好，因此不能确定是假阳性。 载体上带了myc tag，不知做免疫荧光来检测是否可行？谢谢 答：原理上可行。如果免疫荧光对你来说比wb更熟练的话，你可以选择用荧光来检测。反之，还是用wb检测，再把实验尽量做得好一些。用wb的话，可以用你target蛋白的特异性抗体，也可以用anti-myc的抗体，最好两者都做了， ...

问： 这几天做293细胞的脂质体转染，为腺病毒的包装阶段. 用最小的培养瓶（好像是25ml的），加入脂质体10μl，pacI酶切纯化物8μg 进行转染.细胞最密处为80-90%，大部分为60%左右. 48小时后，1/3的细胞漂起来，但有荧光出现.4天后漂起来一半，最密处的视野见20个左右的荧光.以前细胞相对稀疏的地方，仅有很少的细胞还附壁，完全无法见到荧光，即除开原先细胞较密的一小处外 ...

问： 构建逆转录病毒为载体的DNA（质粒），阳离子脂质体2000（过期的），转染病毒包装细胞pt67，G418筛选，在换液和传代过程中均会有细胞死亡（贴壁细胞漂浮）。求教原因。 换液3.6ml DMEM+0.4ml新生牛血清+24μlG418 传代用胰酶ph 7.2，1ml，用0.3ml新生牛血清中和，800rpm离心5min，弃上清，加入上述培养液。 答： 做一下G418浓度筛选，另外你的 ...

丁香园网友fxlys412： 我是刚刚开始接触实验的，对很多东西我都不太懂。所以想请教下各位达人。 我的问题是：要将一外源性基因转染PC3细胞，然后观察抗肿瘤药物对细胞的凋亡影响。 我现在不知道如何下手，是用腺病毒转染还是脂质体呢？该如何选择？ 丁香园网友jollyyyhan认为： 两个都可以啊，我经常用的是脂质体，效率还是蛮高的。不过据说瞬时表达效率高，稳转的好像病毒载体要好筛选一点呢 丁香园网 ...

问： 想请教各位：我在转染后要挑克隆，现在不知道该怎么做？我是在培养瓶中养细胞，现在用Ｇ４１８杀之后，克隆已经形成，且克隆间间距较大，如果要挑克隆该怎么做呢？谢谢！ 答： 可以用滤纸片消化法对单个细胞岛进行消化。可以根据细胞岛的大小，裁滤纸片的大小。灭菌后使用。 ...

有限稀释法的程序 ①制备饲养细胞悬液 ②转染了重组质粒后的细胞计数，并调细胞数在1～5×10３/ml ③取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液 ...

问： 各位好！我现在在大鼠脑组织的mRNA的原位杂交，测BDNF，DAB显色的时候有淡黄色，但是复染之后就是满视野蓝核了，只有零星的阳性结果，并且据文献报道以神经元阳性细胞多见，但是我是胶质细胞的阳性多于神经元，几乎神经元都没有阳性细胞。我用的是地高辛标记的寡核苷酸探针，是天津灏洋的，我的试验流程如下：1.二甲苯两次，10分钟每次，100%、90%、80%酒精各一次，每次10分钟。2.打孔液室温1 ...

sjelly：我的CEF在接了马立克病毒后，一直没有病变出现，于是盲传了3代，还是没有病变，但是每一代提基因组还能P出病毒的条带来，而且很亮。我接了3批不同时间冻存的病毒，其中有两批是以前出过病变的，但是现在不知道为什么变这样了，是哪里出了问题啊？ 丁香园网友bjzhaohong3认为： 不知楼主接种病毒病变时改变血清浓度没有，我们养细胞时血清是10%.而稀释接种病毒时血清浓度是2-3%. sje ...

wo4haoren：，小弟正在用G418筛选单克隆，用的是平皿，一个平皿长了大概几百个吧，但是怎么把单克隆消化，转板呢? 没有想到好的方法，想定点消化，发现胰酶会很快扩散，消化到其他克隆，很郁闷，有做过的大侠交流下经验，不胜感激！ 丁香园网友cmingwen认为： 可以用枪头或者是无菌的东西把单克隆刮下来，再放在孔板培养，应该可以！ 丁香园网友xinyinhancidian认为： 一般是用克隆环， ...

转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型（对于困难的细胞系尤其如此），需要被转染的分子（DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质），转染试剂等。但无论在何种情况下，转染的成功均取决于转染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要素。 细胞： 分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。同样重 ...

xunmixm问： 请教有经验的网友们，我利用重组后的腺病毒感染原代培养的小脑颗粒神经元，转染率在5%左右，但是发现凡是转染进去GFP的神经元全部死亡，（而转进GFP的杂质细胞－如胶质细胞状态良好），神经元表面好像桑葚状，感觉要碎掉了，有的漂起来，看不到有GFP标记的神经轴突。 请教如下问题： 1.造成上述神经元死亡的原因是什么呢？ 2.如何提高腺病毒的转染率？可能我的病毒滴度还不够高。我的操作是 ...

1.应该是可以的，但是脂质体2000的细胞毒性的确比较大，如果细胞比较敏感的话不建议使用。罗氏的FugeneHD细胞毒性比较小，而且效率也高，特别是对原代细胞，肿瘤细胞和干细胞。悬浮细胞的话还是电转吧。 2.可以，用脂质体2000转染Hela细胞，没感觉对Hela细胞毒性大，而且转染效果在70%以上。有过在转染过程中要注意边加入边摇晃液体，以免脂质体2000对局部细胞产生毒性作用。 ...

geniusma问： 准备做hepg2的转染试验了，实验室常用的的是lipofectamine 2000，听说hepG2的转染效率很低，并且这种细胞比较容易成团，这会影响转染效率吗？是否用trypsin+EDTA可以使其成为单个细胞不成团？哪种转染方法更适合hepg2?需要改用电转吗？如果用lipofectamine 2000，加入的比例如何?请有经验的朋友告知详细情况，谢谢！ 丁香园网友star ...