western-blot

我最近两个月一直在做ECL western，非常困难，都快做疯了，有几条个人经验供参考，对改善困难的非特异带和背景应该会有帮助：1. 不要用平底小盒或杂交袋，用可以旋转的杂交管（可以用50ml塑料离心管做成），我刚刚得到了比较结果，效果大不一样。2. 膜在blocking前先用stripping buffer处理一下（当然也在杂交管中进行，注意要通过旋转使处理均匀）。我偶然发现经过该处理后背景异常干净。并且经多次重复后得出此经验。 ...

Western Blot一．配胶1．注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。2．分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶 ...

试剂配制（一）母液1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0 约10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98） 1 ...

是该公司结合自己产品的一个说明，但其中有些知识我自己认为很有用，转下来。下面的步骤适用于通过Xcell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最佳效果，用户的优化是必要的。I. 所需材料： • Xcell SureLock™或Xcell Ⅱ™ Mini-Cell以及Blot Module（Cat. Nos. EI10001, EI9001及EI9051）• 电泳后的迷你胶（mini-gel）（最大的尺寸9cundefined9cm）• 预先切割好的印记膜：硝酸纤维素（Cat. no. LC20 ...

蛋白提取：１． 总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加undefinedPBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加 A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入 10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。每次 ...

前段时间在别人实验室学做western，做了若干次，感觉很容易呀！当然了，别人那试剂都是现成的，技术也成熟，每次都有结果呀！然后回自己实验室来也学着别人的样开始搞。我们这是个新的实验室，什么都没有啊，只有仪器，我买瓶瓶罐罐啊、试剂啊，然后刷刷洗洗，配各种溶液～～～～～～溶液真是多啊，我配了3天才完全配好！特别是调pH太耗时间！开始做了！做胶：别人实验室是用琼脂粉封底，我记得他们是5％，我自己一配，怎么这么稠啊(加热中）！完全搅不 ...

Western-Blot操作流程试剂配制（一）母液1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0 约10ml1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。0.2mol/L NaH2PO4 ...

蛋白质的检测与分析——Western blot 操作步骤一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质（或酶）。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western（西）印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并 ...

一直感觉园子里针对Western Blot实验的帖子很多，最近浏览了一下蛋白实验的论坛，看到还是有很多同学遇到各种各样的问题，我就把我们实验室比较成熟的Western Blot实验步骤整理了一下，也挂出来供大家参考一下，希望对您的实验有帮助。实验步骤：1.分别配制 5%浓缩胶和12%分离胶 12%分离胶10mL 5%积层胶6mLH2O 3.3mL H2O 4.20mL30% Acrylamide 4mL 30% Acrylamide 1mLpH8.8 Tris HCl（1. ...

我是一个门外汉，刚刚做WB。做出来后全是模糊的片子，还有就是只有黑点，没有条带。一直没找到原因。恳请各位高人教导。并且按照以下的方法做。我做的是SD大鼠骨骼肌组织的蛋白检测，取300mg肌肉，最终加2.4ML裂解液。10000转离心10分钟。定蛋白也是按一下方法。上样按每10微升80微克蛋白上的样。用的是大连竞迈公司的垂直电泳仪。装模是半干法，按没分钟1KD转的。一抗1：1000.二抗1：6000。。 我测的蛋白在95KD ...

1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其 ...

摘要：本文主要是针对Western bloting的原理及操作进行了简单的阐述，Western印迹法是利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDS-PAGE电泳分离开来，然后再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复合物，利用发光或显色原理将结果显示到膜或底片上。同时对Western bloting在实际操作中应注意的细节问题进行了归纳以及与其它免疫技术就抗体检测方面进行了比 ...

转至于http://www.51protocol.com/pro/WesternBlotting/20071031/38742_2.html初涉WB，与大家一起学习：）样品处理　　由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。　　注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。培养的细胞（定性） ...

Westernblot基本流程1.蛋白处理：此步骤是关键，蛋白处理的好否决定结果好坏。取细胞，3000rpm 3min离心，加入含蛋白酶抑制剂（现做现加）的细胞裂解液(本实验室选择RIPA，1×106/L细胞对应100ul)，枪尖反复吹吸裂解细胞（此步非常重要，容易出现鼻涕样的液体，此为裂解不充分的缘故，所以应反复吹打或者置于振荡器上，直至鼻涕状液体消失）。冰上放置至少半小时。2.煮蛋白：12000rpm，15min离心，吸取 ...

由于本人刚刚进入实验室，没有任何经验，不知道各位大哥能否给于指导，告知具体的实验注意点。谢谢各位大侠Cx43、Cx40蛋白表达的测定2.6.1血管组织的匀浆取血管标本100mg置玻璃匀浆器中，按100mg/ml的比例加入裂解缓冲液，4℃下手工碾磨10-15分钟至肉眼看不到组织碎片，置离心管中于4℃低温离心机以14000ram离心15分钟，取上清液分装保存在-70℃深低温冰箱备用。2.6.2 蛋白浓度的测定用Bradford ...

1Western blot 方法大全http://www.dxy.cn/bbs/thread/8569374http://www.dxy.cn/bbs/thread/6235976http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/7063455_1.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=30771&sty=3&keywords=western+blothttp:/ ...

Western－blotting：SDS-PAGE和免疫印迹一：蛋白质的提取1、取出细胞，倒去培养液，用PBS洗涤细胞一次，充分除去PBS液体，把细胞置于冰上。配置细胞裂解液，细胞裂解液用灭菌水配置，然后按照1：100比例加入PMSF混匀，然后按照细胞的多少加入裂解液于培养瓶中，在冰上放置20min。在此期间每隔3-5min摇晃培养瓶，让其充分裂解细胞。2、裂解结束后，吸取裂解液于另一只1.5ml离心管中，于4℃1300 ...

1.常见问题分析http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=4620021&sty=1&tpg=1&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=4043308&sty=3&keywords=western+blothttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=3861374&sty=3&keywords=western+b ...

在Youtube上查找的几个WB视频，共享一下，有要做的战友可以参考一下：http://www.youtube.com/watch?v=iUrK9FuMAgs&feature=relatedhttp://www.youtube.com/watch?v=nqspgMGNsrU&feature=related原理讲解http://www.youtube.com/watch?v=SahgDkDSutk Western Blot (1/2)http:/ ...

Western blot实验是目前进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一，其原理是经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。West ...