蛋白表达

蛋白表达系统已经发展到了令人惊讶的顶峰时代。最近30年来，科学家们已经推动了基因工程、重组技术、纯化指南和性质鉴定等技术的急剧发展。其中包括驾驭病毒和细菌质粒的天然性质的能力，这些“carriers”将运载外源基因到宿主细胞中，然后被转化成蛋白。经过许多年的发展，蛋白生产能力的提高已经在进一步理解基因的功能和所编码蛋白的功用和相互作用等方面起到了积极作用，也将为寻找如单克隆 ...

我想表达遇到的第一个瓶颈估计就是为什么我的外源片段插到载体里面，PCR鉴定没问题，双酶切也OK，可是就是不见表达。一般我们是如何判断没有表达呢？大多都是首先进行SDS-PAGE。在跑胶的时候一定要设对照，比较严谨的电泳对照，应该是：Marker，标准品阳性对照（如果有，且打算做Western的话），以及空白载体（诱导）和重组载体（不诱导）2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。Marker用于 ...

作为分子生物学领域老牌厂家，Promega同样有很有特色的原核表达系统，不过纵观Promega近年的表现，似乎不满足于此，而是将目光投向了跨物种间的穿梭表达，以及越来越热的体外表达系统了。 蛋白纯化，永远是蛋白表达后最令人关注的问题。Promega的 PinPoint™ Xa 表达系统则是巧妙利用了生物素作为亲和纯化的中介――将目的基因克隆到表达载体上的一段“神秘&rdqu ...

在重组蛋白纯化的过程中，研究者常常利用融合表达的各种亲和标签，通过一步法亲和纯化的方法获得自己的目的蛋白。其中，6×His•Tag标签因其氨基酸个数少、对蛋白活性影响较小、亲和纯化方便，成为大家常用的选择。但是，His Tag并非万能标签，依然有不少使用限制因素，如：对重金属离子敏感、不适合金属离子螯和层析方法的蛋白；活性不稳定的蛋白；对蛋白纯度要求更高等。所 ...

研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是表达――即：有目的性地合成外源基因产物。在重组DNA技术的发展早期，人们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编 ...

1．启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为 ...

yhbdxs:实验思路是这样的，将目的基因连接到含有GFP的表达载体上，得到GFP和目的基因的融合蛋白，再纯化。 我现在还没有选定用哪个载体，请你们帮帮我，太多不清楚的地方了。 E.coli:通常在进行原核表达实验时，选择使用pET系列载体居多。但是pET系列载体不带有GFP基因，其上的His Tag标签是专门用于分离纯化的。通常情况下，目的基因与GFP蛋白融合，用于真核表达的实验较多。 yhbd ...

将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点： 易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学 ...

通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。 以pET-32a(+)为例，介绍将目的基 ...

近年来Qiagen公司无论在分子诊断方面，还是核酸、蛋白纯化方面都有出色的表现。在分子诊断这一块，根据Kalorama Information网站自2003年的统计，它作为分子诊断公司世界排名第九。在今年5月31号，它收购了artus公司，这是一家针对病原体、基因型和药物基因组学测试提供基于聚合酶连锁反应 (PCR)分子诊断公认的领导厂商，估计它作为分子诊断学公司的排名还将继续攀升。在核酸、蛋白纯 ...

本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主 ...

讲起通用电气医疗集团(GE Healthcare)也许生物方面的研究人员会比较陌生，这个从爱迪生的灯泡讲起，拥有百年历史的大集团包括许许多多的行业（当然也不要盲目崇拜把通用汽车也归到旗下，GM会生气的），可是讲起蛋白纯化等领域首屈一指的安玛西亚，特别是ECL系列和当年的法玛西亚的Sepharose、Sephadex等大名鼎鼎的纯化填料，那么许多做蛋白的人都很熟悉。美国通用电气公司2003年10月以 ...

一、原理 1、E .coli 表达系统 E .coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E .coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。 2、外源基因的诱导表达 提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-& ...

甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过 ...

目前构建重组腺病毒系统的策略，主要有三种 1)体外直接连接(clontech的ADENO-X系统) 2)在细菌中重组的策略(adeasy系统) 3)在293细胞中重组的策略（AdMax系统） 国家人类基因组北方研究中心通过与美国Vector Biolab公司合作开发出了一套不同于以上策略的新的重组腺病毒系统。通过这套系统，实现了重组腺病毒载体构建，包装的高通量化。在不到一年的时间里，成 ...

在基因表达研究中，研究者比较注意选择合适的表达载体和宿主系统，而往往忽视基因本身是否与载体和宿主系统为最佳匹配这样一个实质性问题。基因的最佳化表达可以通过对基因的重新设计和合成来实现，如消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化，调整GC含量等。以下就密码子最佳化、翻译终止效率和真核细胞中异源蛋白表达的问题加以说明。 密码子最佳化（codon optimization） 遗传密码有64种，但 ...

研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是表达――即：有目的性地合成外源基因产物。在重组DNA技术的发展早期，人们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编 ...

在人细胞中快速、高水平地表达目的蛋白 在2至3个星期内即可获得高效价的病毒 无需噬斑纯化 靶细胞可以是分裂或不分裂的细胞（dividing/or nondividing cell） CLONTECH的Adeno-X™表达系统是一个特别 高效的腺病毒表达系统，用于在人细胞中瞬时及高水平地表达目的蛋白质。由于Adeno-X™病毒DNA中含有特别设计的克隆位点，你可以在2星 ...

Purification of GST fusion proteins in E.coli GST Sugden labMcArdle Laboratory for Cancer ResearchUniversity of Wisconsin-Madison Medical School Screen of GST-Fusion Protein Expression (pGEX system by ...

人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质――胰岛素。随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等 ...