PCR扩增

巢式PCR的定义 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通 PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢 式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢 ...

PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。这时改变已知对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。 1. 降落PCR 降落PCR代表了一 ...

一、污染原因 1. 标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 2. PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶 ...

一、增加PCR的特异性 1. primers design 这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件 （1）足够长，18-24 bp，以保证特异性。当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性，并且降低产量。 （2） GC% 40%-60%。 （3）5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性。 （4） 避免3'端G ...

1. 问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 可能原因： （1）RNA被降解 建议解决方法： 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA； 在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA； 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在&g ...

1、PCR产物的电泳检测时间？ 一般为48 h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48 h后带型不规则甚致消失。 2、假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色 ...

做了快7年的分子克隆，从加样加不好，到现在轻松PCR，我想分子生物学这块还是有很多经验可以分享一下的。或许很多人会说分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了，大家抱怨的也最多，我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会，我认为连接的问题多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。有很多 ...

什么是PCR实验的灵敏度? 灵敏度指的是PCR扩增反应能够检测到目的基因的最小值。研究结果表明，影响PCR扩增效率的因素，如模板的复杂程度与完整性、引物的纯度及其与模板的结合效率、反应温度、DNA聚合酶的热稳定性与扩增性能、反应缓冲液的离子组成（主要指阳离子）、反应优化剂等等，都决定了PCR实验的检测灵敏度。 在最佳的扩增条件下，常规PCR反应能够检测到的pg（10-12g）数量级 ...

1．假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增 ...

1. 引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 设计引物应遵循以下原则： （1）引物长度： 15-30 bp，常用为20 bp 左右。 （2）引物扩增跨度： 以200-500 bp 为宜，特定条件下可扩增长至10 kb 的片段。 （3）引物碱基：G+C 含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。A ...

实验原理 单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用DNA聚合酶按5’→3’方向复制出互补DNA。这时单链DNA称为模板DNA，寡聚核苷酸片段称为引物（Primer），合成的互补DNA称为产物DNA。双链DNA分子经高温变性后成为两条单链DNA，它们都可作为单链模板DNA，在相应的引物引导下，用DNA聚合酶复制出产物DNA。 PCR反应应用以 ...

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： （1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 （2）模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 ...

常见问题 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性，不出现扩增条带。 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模 ...

基本概念 聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction） (又称：多聚酶链式反应），聚合酶链式反应，其英文Polymerase Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期循环进行使目的DNA得以迅速扩增具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基 ...

一、目的了解多聚合酶链反应DNA 扩增技术的基本原理和实验应用，掌握PCR反应基本技术。二、原理PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制 ...

PCR扩增样本DNA的HLA基因片段（一）PCR扩增体系（1） 1.0uM 引物（2） 300ng待测样本基因组DNA（3） 2.0U Taq多聚酶（4） 200uM 各种dNTP（5） 用1 X PCR缓冲液（10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.01%明胶）调至总体 ...

PCR扩增产物的RFLP分析（一）PCR产物用各种限制性核酸内切酶酶解将PCR扩增产物分装，并用下列不同的限制性核酸内切酶酶切DR1：Ava II，Pst IDR2：Fok I，Sau 96，HpH IDR3、8、11、12、14：Ava II，Fok I，Kpn I，Hae II，Sau96，SfaN I，Sac II，Apa I（1） 将8ul PCR扩增产物与1ul相应的酶 ...

通常所用的PCR方法都在目标产物精确程度和合成片段的大小两个方面有局限。利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增并使两种类型酶的接近最佳配比即可使反应有效进行。

微卫星（microsatellite analysis）即短串联重复序列(Short tandem repeat，STR)，它是由2-6bp重复单位构成的DNA序列，通常扩增获得的多态性长度片段范围在100-400bp之间。STR基因座广泛地存在于哺乳动物基因组中，以人类基因组为例，平均每15-20kb就存在1个STR座位，据此估计整个人类基因组中大约有50000-100000个STR ...