PCR引物设计

PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高 模板核酸的产量. 　　传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏 ...

Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真菌，能在70～75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的. (一)酶活性与热稳定性　　该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70℃延伸率 ...

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生. 一、污染原因　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污 ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失 ...

PCR技术自1985年建立以来，发展之迅速、应用之广泛，表明其具有强大的生命力.近些年来，基于PCR的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对PCR技术进行研究和改进，使PCR技术得到了进上步地完善，并在此基础上派生出了许多新的用途. 原位PCR技术　　原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项 ...

生物界的丰富多彩很大程度上取决于严格调控下的基因的选择性表达。高等生物的细胞内约含有105个不同的基因，而主 基因在某个特定的细胞中，只有占15％的一小部分表达。而且在不同的细胞中，选择性表达的基础也是不同的。正是这些基因的选择不同决定了整个生命的过程：如细胞的生长分化，激素和细胞困子对细胞的作用、细胞周期的调控以及衰老、死亡等。和细胞的正常生理一样，一些病理的反应如肿瘤等也是由基因表达的改变引起 ...

一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：　　通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校读活性（3'-editing-exonuclease），可以将每个循环中碱基的错配率由1undefined-4降到1undefined-3，从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klent ...

平端连接　　通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5―10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于 ...

凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种. 一、琼脂糖凝胶电泳:　　琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连 接等.(一)凝胶浓度　　凝胶浓 ...

PCR技术（多聚酶链式反应）是现代分子生物学的一个巨大突破，它能在体外迅速、 大量、灵敏地扩增基因片段。可是，经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效 拼接，却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点，这不但操 作繁杂，而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因 拼接的新方法，即SOE和SDL法，就能巧妙地解决这个问题。 SOE法　　1989年，Hort ...

随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问 世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称 PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性 片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等等已成 为基因分析的 ...

进化遗传学具有两个并列的研究方向：系统发育的重建和种群分析。自1962年， Zuckerkandl和Pauling提出蛋白质序列和基因序列的比较可以象分子种一样用于标志 现存物种分化的时间以来，各种生化方法被用于系统发育的研究。在最初二十年内， 同功酶的电泳分析、免疫学比较和蛋白质序列分析被广泛地应用。而最近，DNA-DNA 杂交和核糖体RNA序列分析为分类学做出了重要贡献。这些技术大多有局限性， ...

高等生物遗传图谱的构建依赖于选择性杂交后代的分析或者通过家系分析法来计 算连锁关系。对人类而言仅后者是可行的。使用长度多态性限制片段（RFLPS）在构 建人连锁图谱方面已取得长足的进步。为了对带有与已知表现型相关的RFLP标记的基 因进行定位，首先得建立间隔约10CM的遗传标记束（平均1CM等于1％重组），这样没 有基因离标记RFLP的距离会超过5CM。可靠的统计表明家系分析能够检测的遗传间距 精 ...

PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测 序技术相结合后，它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综 述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质 粒或病毒基因组相比，直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一个不依赖于生 物体(如细菌、病毒等)的体外系统，因而它更容易标准化(即例于自化2);对于每个待 测样 ...

最常用的基因分离方法需要建立组织或细胞RNA的cDNA库，然后用抗体或 DNA探针筛选出感兴趣的基因。虽然这个方法已成功地克隆了大量基因，但建立和筛 选CDNA库是一项非常耗时．费力的工作，而且用寡聚核苷酸作探针进行筛选需大量蛋 白质序列结构的资料。聚合酶链的反应（PCR）方法可使一种特异DNA扩增几百万倍， 并已成为分子克隆和诊断的十分有用的工具。最近，TAQDNA聚合酶的使用极大地简化 了PC ...

Contents Factors Affecting the PCR Denaturing Temperature and Time Annealing Temperature and Primer Design Primer Length Degenerate Primers Elongation Temperature and Time Reaction Buffer Cycle Numb ...

REVERSE TRANSCRIPTION PCR: RNA - LOTS OF DNA Contents Reverse Transcription Reaction Polymerase Chain Reaction Reverse Transcription Reaction: This provides the cDNA - by extension from a primer compl ...

A method to re-PCR unique bands from products of mixed size Contents INTRODUCTION PROTOCOL COMMENTS INTRODUCTION The products of a PCR reaction - especially when this is done on eukaryotic genomic DNA ...

General Advice PCR allows the production of more than 10 million copies of a target DNA sequence from only a few molecules. The sensitivity of this technique means that the sample should not be contam ...

General Advice PCR allows the production of more than 10 million copies of a target DNA sequence from only a few molecules. The sensitivity of this technique means that the sample should not be contam ...