其他PCR技术

增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3'端 ...

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=3226158&sty=1&tpg=14&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=3225948&sty=1&tpg=14&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=3223640&sty=1&tpg=14&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/ ...

再求助内参，接上次？http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5744926&sty=1&tpg=7&age=0人口腔鳞癌Tca-8113细胞 端粒酶检测引物设计和内参引物http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5745223&sty=1&tpg=7&age=0搞不懂的PCR结果http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=57 ...

2006.3.1~3.31 不规范帖除外，请大家规范发帖！【求助】怎样在EGFP载体前加入SP6启动子http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5634193&sty=1&tpg=40&age=0【求助】BAT40 微卫星大小http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5639177&sty=1&tpg=40&age=0【求助】POPGene分析请教http://www.dx ...

参考体系酶切体系（参考）：质粒 17ulbuffer 2ul酶 1ul－－－－－－－－－－37度，过夜。酶切位点在质粒上，所选的两个酶的酶切位点不可以靠的太近，如6bp建议载体质粒不要用双酶切,用两次单酶切之后切胶回收.另外建议加多以下两个个步骤:1.PCR产物的酶切片断做TA克隆,之后再酶切回收,与载体相连.2.目的片段与载体连接之后建议先转化DH5α这些容易转化的菌株. 然后筛选到的阳性克隆测序之后,提质粒,用质粒转化BL21,转化率很高 ...

PCR的问题，无疑是绝大多数学生物的人都关心的问题，小编将相关内容整理出来，与大家交流讨论，希望对大家有所帮助。由于内容过多，分成了几个部分：引物设计、PCR成分、PCR反应参数、提高PCR扩增特异性、PCR污染与对策。　　好东西收藏在手边，查看其它系列内容，请在GCBI微信页面输入“PCR”，即可查看下面的内容：　　引物设计　　PCR成分　　PCR反应参数　　提高PCR扩增特异性　　PCR污染与对策　　所谓“工欲善其事，必先利其器”，设计引物常用软件：在线P ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时 ...

影响PCR结果的关键因素总结前人所说，多指教！理想的PCR反应应该是特异、高效、忠实的。研究表明PCR结果的特异、高效、忠实性都受反应中众多成分的影响，包括缓冲条件、PCR循环方式（温度和每一步的持续时间）以及DNA聚合酶等。而许多研究人员往往把PCR结果的不理想过多的归罪于引物合成的质量。其实想得到一个好的PCR结果除了要有高质量的引物外，还需要对以下每个因素的恰当控制。1，模板包括基因组DNA、质粒DNA和噬 ...

如何确定是TAG出错，还是模板变异？我的测序结果怎么不对？合成c-myc、c-myb、pcna的as-odn求助 帮忙设计嵌套PCR的引物有人用过Takara的mutanbest试剂盒么?差异显示电泳设备的选择？关于同种不同品系看家基因的可比性问题基因特异性引物如何设计? oligodT共1OD时怎么进行稀释用于RT?b-actin作内参时如何使结果归一的原位RT-PCR是否既可定量又可定位？讨论：SSCP分析基因多态性 ...

1。二次PCR的第一次PCR产物应该稀释多少倍http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/622786_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/623784_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1025255_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/ ...

PCR实验操作程序1. 在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：反应物 加样顺序 体积(μl) 终浓度去离子水 1 29.410×Buffer B 2 5 1×4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/LMgCl2 4 3 1.5mmol/L有义引物 5 2.6 0.25μmol/L反义引物 6 2.6 0.25μmol/L模板 7 2 0.1μgTaqDNA聚合酶 8 0.4 1unit2.用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50μl矿物油。每加一管换一次Tip。3.振荡每只管，然后短暂离心。4.将管放到 ...

关于新基因的克隆，有几种方法，其中关于PCR的有：1．简并引物PCR法根据编码氨基酸的密码子的摇摆性，将编码一种氨基酸的多个密码子并列设计成一组引物进行PCR扩增，适用于克隆已知氨基酸序列的基因、某基因家族的新成员和不同物种的同源基因。可根据氨基酸序列推测核酸序列，或根据基因家族已知成员的核酸序列，选其保守区或相对保守区设计简并引物，然后用PCR法从一定组织的cDNA文库中扩增目的基因。该法结合3’RACE（r ...

呵呵，希望各位高手多多参与，及时帮助广大战友解决问题哈！质粒做realtimepcr用的标线的几个问题普通的RT-PCR所用的引物能采用文献中Real Time PCR的引物吗关于位点特异性引物设计无脊椎动物的内参照用什么豚鼠RT-PCR内参是什么请教PCR问题关于内参的问题/G+的链球菌（原核）的内参是什么长PCR分段扩增后的酶切连接问题,PCR带消失了测序结果信号差的原因扩增支原体16srRNA基因如何设置内参 ...

以下为自己参考书籍整理，希望能对新手有一点帮助。我自己也是新手，想和大家共同进步！影响PCR反应的参数PCR反应的基本成分PCR包含7种基本成分1.热稳定DNA聚合酶：常规PCR，最常选用Taq DNA聚合酶（每个标准的25～50μl反应体系用0.5～2.5U）。（实验室Taq DNA聚合酶为5U/μl）2.一对引物： 这是影响PCR反应的最关键因素。标准PCR反应每条引物的典型浓度是0.1～0.5 μmol/L。（实验室所用引物按要求稀 ...

xjktony扩增模板的GC 含量为66％,也不算很高,我做过更高的GC 含量(80%)的PCR.对于这种高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二级结构的影响,当然现在也有专门这种PCR Buffer卖.vanny宝生物有这种做高GC含量的酶和buffer，称为LA TAKARA酶，里面有GC buffer，效果还不错。westernblot你用DMSO5％加到里面，60％应该不是算高的，如果实在不行，就用advantage 2 high ...

【求助】有谁做过透析袋电洗脱DNAhttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5875697&sty=1&tpg=32&age=0【求助】用superscript III做5' RACE的方案，请指点http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5876087&sty=1&tpg=32&age=0【求助】请问PRIMER PREMIER 有几版啊?http://www.dxy.cn/b ...

各位大侠：我是PCR新手，第一次作PCR，模板是含ANX A5的原核质粒。ANX A5的DNA全长如下ccatggcaca ggttctcaga ggcactgtga ctgacttccc tggatttgatgagcgggctg atgcagaaac tcttcggaag gctatgaaag gcttgggcac agatgaggagagcatcctga ctctgttgac atcccgaagt aatgctcagc gccaggaaat ctctgcagc ...

提问：降落PCR（Touchdown PCR）的原理？回答：Touchdown PCR是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度，直至达到“Touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异（每摄氏度造成4倍差异）。因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集该方法的另一 ...

该贴转自生物试验网2007年9月14日发表的文章实时定量PCR以其精确、快速、方便，越来越多的应用在科研、临床及检验检疫的各个领域。但是定量PCR是对精确性要求很高的实验，实验的条件对实验结果的影响非常大。在此谈谈体系优化的问题，希望对做相关试验研究的战友有所帮助1.基本参数的优化：1）MgCl2的浓度：在PCR反应中，MgCl2的浓度对酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低 ...

用石蜡组织提DNA做MSPhttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=6074962&sty=1&tpg=17&age=0【求购】求购内切酶BbsIhttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5999059&sty=1&tpg=29&age=0【求助】http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=6081074&sty=1&tpg=16 ...