PCR技术原理

自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研究中使用最多、最广泛的手段之一，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。 现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本 ...

PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 一、模板 1、模板中含有杂蛋白质 2、模板中含有Taq酶抑制剂 3、模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白 4、在提取制备模板时 ...

PCR技术（多聚酶链式反应）是现代分子生物学的一个巨大突破，它能在体外迅速、大量、灵敏地扩增基因片段。可是，经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效拼接，却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点，这不但操作繁杂，而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因 拼接的新方法，即SOE和SDL法，就能巧妙地解决这个问题。 SOE法 1989年，Horton等人 ...

Procedure 1. Set up the following PCR tube: 5 μl of 10X Taq Buffer 5 μl of 25 mM MgCl2 2 μl of 10 mM dNTPs 10 to 100 ng of template DNA 25 pmol of specific primer 1 25 pmol of specific ...

Important parameters in the PCR: 1.Template DNA quantity (complexity determines ng) and quality (average length) While people typically measure DNA quantity in ng the relevant unit is actually moles i ...

荧光染料 荧光基团通常各自拥有单一的光吸收峰。在光的刺激下，荧光基团吸收光的能量后通常以三种方式释放出能量： 一、光能 许多荧光基团吸收光能后仍旧以光能形式释放能量，并且发射光的峰值大于吸收峰。比如荧光染料Fam的光吸收峰为490nm，而发射峰为530nm。 二、热能 某些荧光基团吸收光能后，能量转换为热量扩散到环境中，如Dabcyl。 三、转移给临近的分子 当临近的分子满足发生能量转移的要求时， ...

PCR技术简史 一、PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 二、PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具 ...

增加PCR的特异性 一、primers design （一）理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件 1、足够长，18-24bp，以保证特异性.当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性，并且降低产量。 2、GC%： 40%~~~~60% 3、5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性。 4、避免3'端GC rich，最后3个BASE不要有GC，或者最后5个有 ...

检索途径 在进行文献检索时，我们可根据文献的内部特征或外部特征进行检索。 文献的内部特征是指文献所论及事物，所提出的问题，涉及的基本概仿即主题以及文 献内容所属的学科范围都是文献的内部特征； 文献的外部特征包括题名，作者，作者单经以及某种特殊文献自身的特征标识。如专 种文献的专利另科技报告的报告号，标准文献的标准号等等。 分类途经：从学科角度将文献内容划分到某一学科内，根据文献内容所属的类检索文 ...

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 一、污染原因 （一）标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 （二 ...

基因突变(gene mutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因，检测与遗传病及恶 性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)是分子生物学，医学遗传学及肿瘤学研究 的热点，它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要 ＼意义，分子生物学技术的发展，尤其是PCR技术的出现及近年来以PCR技术为基础， 结合传统技术的突变基因分析方法为人们提供了许多快速、简便、准确的基因 ...

由Mullis等在1983年建立的PCR技术已成为分子生物学、遗传学等学科研究领域的经典实验方法。近年来该技术本身获得了长足发展可靠性不断提高在聚合酶链式反应基本原理的基础上发展了一系列新的概念和实验方法在生命科学研究中具有重要价值。 实时定量RT - PCR的原理、方法和应用 1、实时定量RT - PCR的原理 实时定量PCR的发明归功于两个重要的发现:一是发现DNA Taq酶有5′ ...

PCR技术基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 ...

FocusonPCR IntroductionMore than 15 years after its initial description the polymerase chain reaction (PCR) has become a standard molecularbiology tool and is the most widely used method o ...

DNA Marker产品选择指南 1.Marker选择标准（1）应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。（2）所选marker应能清楚反映目标片段的大小，且次要片段大小也能反映出来。如作酶切鉴定时，目的片段和切后载体片段最好能在同一个marker中反映出来，若二者不能兼顾，将前者作为主要考虑要素。 2.常见问题分析Q：为什么marker条带非常模糊， ...

Disruption by Fusion PCR 1) In separate PCR reactions amplify the 5' and 3' ends of the gene of interest with primers about 200 bases apart. Primer 2 should begin with 24 nts complementary to t ...

Detection of Alu by PCR In this experiment polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify a nucleotide sequence from chromosome 8 to look for an insertion of a short DNA sequence called Alu ...

Designing PCR programs 1Basic Principles The requirement of an optimal PCR reaction is to amplify a specific locus without any unspecific by-products. Therefore annealing needs to take place at a suff ...

A method to re-PCR unique bands from products of mixed size INTRODUCTION The products of a PCR reaction - especially when this is done on eukaryotic genomic DNA and when using degenerate ...

Colony PCR This procedure will work for both yeast and E. coli: Take a small colony and suspend it in 5ul of H2O in a PCR tube. Heat for 5 min at 95℃ and then spin the condensation down ...