PCR技术原理

一、实时荧光Taqman 探针设计 总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。 在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上 ...

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。实时定量PCR(real-time quantita ...

背景：生物科学和有关技术的发展为恶性肿瘤的诊断和治疗提供了分子学依据。当前，外科病理学主要依据肿瘤的解剖特点（如：转移瘤）和组织病理学对恶性肿瘤分类。微阵列连同聚类分析揭示了肿瘤分子的差异多样性，靠这一点有望建立一个新的与预后有关的分类方法，更重要的是，对疗效有重要的意义。病理学上的挑战将成为常规临床应用分子学分类的发展和补充。 方法：本文重点放在临床实验室中用以DNA为基础的PCR技术来了解实体 ...

在论坛上看到不停地有人在问RT-PCR的问题，实际上在以前的帖子中各位香主和eeflying（我为什么总是提他们？因为还是很佩服的哦，生怕自己说错了，被他们指出来哦）都谈到了很多，鄙人也充大头答了一些问题，但是还是有各种问题，由于的基因表达还有点实战经验（但也技止此而），所以想些点东西给大家参考，计划把包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR都 ...

1、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74°C，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3、引物3’端的末位碱基对Taq 酶的 ...

一、引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 1.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误 ...

一、仪器设备 英国Thermo Hybaid原位PCR仪。 二、操作流程 （一）原位PCR步骤 1、预处理：　　（1）切片常规脱蜡；　　（2）0.2mol/L HCl处理10min；　　（3）5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min；　　（4）Nase消化组织37℃ 30min；　　（5）梯度酒精脱水，室温干燥。 2、原位扩增：　　（1）切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反 ...

PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。 一、温度循环参数 在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退 ...

ABSTRACT Use of PCR in the field of molecular diagnostics has increased to the point where it is now accepted as the standard method for detecting nucleic acids from a number of sample and microbial types. However, conventional PCR was already an essential tool in the research laboratory. Real-time PCR has catalysed wider acceptance of PCR because it is more rapid, sensitive and reproducible, while the risk of carryover contamination is minimised. There is an increasing number of chemistrie

荧光定量PCR（也称TaqMan PCR以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。本文拟就该技术的特点、原理和方法以及应用作一简要叙述。 一、特点 FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导 ...

一、荧光PCR原理 1．荧光共振能量传递 (FRET) 某荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。 2．荧光化学： 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团 ...

自1987年秋以来，PCR技术的应用开创性地推动了产前单基因缺陷者及携带者的 诊断。目前PCR还不能用于诊断所有已知缺陷疾病，但极大地扩大了实验诊断学家对 诊断方法的选择。JohnHopkins大学的研究人员表明，在诊断基因缺陷疾病方面PCR技 术具有快速、准确、操作灵活等特点。每项进展的实例在以后描述。在1987年10月 前，我们用Southern印迹法产前诊断镰刀红细胞贫血症通常需要两周或更长 ...

多聚酶链式反应( PCR) 是在模板DNA、引物和4 种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖DNA 聚合酶的酶促反应 。在实验室日常工作中经常出现两种情况:一种是因未找到最佳扩增条件导致产生大量非特异性产物另一种情况是未扩增出任何产物。影响PCR 的因素很多除了受 PCR 仪器性能的制约外也取决于反应体系和反应条件的设置其中Mg2+ 浓度、缓冲液pH 值、循环条件等因素尤为重要而循环条件中的退火温度又是 ...

各位先生，各位女士，各位来宾，各位领导，各位海外侨胞，港澳同胞， 欢迎参加两位新人的结婚晚会 哦 啊 拿错了， 这是我明天参加婚礼的发言 这个才是 各位战友 我们来聊聊PCR ：） PCR可以说是目前分子生物学实验中应用最为广泛的一种技术。从最初的在几个水浴锅里把试管放来放去，到现在各种先进的PCR仪， 到REAL TIME PCR。 设备是越来越先进，方法是越来越多，但基本的原理还是那套。然而实 ...

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)简称PCR技术，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于其可使特定DNA片段在数量上呈指数增加至可检测范围，故成为基因诊断的重要方法。在PCR基础上衍生的一些扩增技术已用于基因突变的诊断。目前单基因疾病PGD所用的方法主要是基于PCR技术通过检测单细胞靶基因的数目及结构有无异常加以诊断。 一、聚合酶链式反应 ...

反向PCR是一种多聚合酶链式反应（PCR）应用的方法，可使已知序列的核心区边侧的未知DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR扩增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列，但其方向可使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列探针或测定 ...

1、实时PCR原理 对扩增产物进行可重复性的定量长期以来一直是科学家和研究者的目标。传统的方法需要对终产物进行凝胶电泳分析。这种方法可以确定目的产物和竞争产物的大小，估算纯度，计算条带强度。然而，所用扩增试剂和体系的变动会造成扩增的终产物的重复性有较大的变动，成为这种方法的主要弊端。 扩增过程的指数期提供给我们最有用的，可重复的数据。在起始的目的DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量 ...

Materials: Taq (or other) PCR enzyme (5 Units/ul) PCR enzyme reaction buffer Distilled water (nuclease free) DNA to be used as template such as GAPDH template from Clontech ...

A variety of PCR additives and enhancing agents have been used to increase the yield specificity and consistency of PCR reactions. Whilst these additives may have beneficial effects on some ampl ...

Various authors recommend DMSO and glycerol to improve amplification efficiency (higher amount of product) and specificity (no unspecific products) of PCR when used in concentrations varyi ...