RNA提取实验

本文介绍了RNA的制备与分析方法

本文介绍了RNA的提取步骤和相关注意事项

TRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCO BRL公司推出专供提取RNA的产品，其操作方便、快捷。

异硫氰酸胍法制备组织和细胞RNA：（一）试剂准备：CSB缓冲液

mRNA提取纯化

之前已分别构筑出GUS 基因的表现质体pQG11若要令启动子T5promotor 的启动受到更好的调控，应进一步将pQG11 转形至大肠杆菌M15. M15 可持续表现lac repressorpQG11 上用以驱动GUS基因表现的T5 promoter 的活性将因而受到抑制，但一旦加入IPTG 就能诱导GUS基因大量表现。 在这一节的实验里，我们将分别自经IPTG 诱导与未经诱导的pQG11/M ...

mRNA为单股，一般会卷绕成特定的三级结构，并与某些蛋白质结合，而以messenger ribonucleoprotein particles （mRNPs） 的型式存在于细胞内；自细胞抽取RNA时，一般会以特定步骤去除蛋白质，但仍难完全破除RNA的二/三级结构。 由于进行电泳分析时，影响核酸泳动速率的因子主要包括核酸的长度与构形 （conformation），为了去除核酸构形所造成的影响，一般以电泳分析RNA时都采用变性胶体电泳；在进行这一类电泳分析时，由于RNA已经被变性 （denature），影响其泳动速率的因子主要是长度。 一旦RNA以变性胶体电泳解析好，即可进一步进行北方转印与杂合分析。

如果不是新鲜的（最好在半年之内，-80°或者液氮中冻存的）组织，注意不要反复冻融，从冰冻状态拿到0-4°，注意不要拿到常温，待组织解冻后，用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织，称重后，放到预冷的匀浆器中，然后加入一定量的TRIZOL试剂，然后匀浆。注意：速度不要太快，要匀一会停一会，否则由于摩擦产热，RNA遇热会加速降解。如果一次做多个标本的RNA提取，也要这样做，更不能急。后面的步骤和细胞RNA提取一样。

Before starting protocol：1. Measure out 75 mg of oligo dT cellulose into a 2 ml Sarstedt screw cap tubes.2. Make fresh buffers:……

Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly（A）+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。由于mRNA末端含有多poly（A）+,当总RNA流径oligo（dT）纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo（dT）纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo（dT） 纤维素柱，可得到较纯的mRNA.

Prepare or collect between 2x107 cells for each mRNA prep （will yield about 10-20μg of mRNA）. If PBMCs from a whole blood sample are to be used, the sample should be prepared with Ficoll-Paque according to the manufacturer's protocol. The isolated PBMCs can then be used in this protocol.

由于mRNA末端含有多poly（A）+,当总RNA流径oligo（dT）纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo（dT）纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo（dT） 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3‘末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。

使用该试剂盒，mRNA产量极低，因此下述方法是以Promega公司试剂盒操作手册为基础，并采用储昭晖硕士（作物遗传改良国家重点实验室植物分子生物学水稻分室）所建议的改进方法综合而成。

Reagents 1 U/ul DNase I from Epicentre Technologies 10X DNase I buffer （200 mM Tris pH 8.4 20 mM MgCl2 500 mM KCl） For 1ml: 200 mM Tris pH 8.4 200 ul 1M Tris pH 8.4 500 ul 1M KCl 20 ul 1 M MgCl2 280 u ...

Overview Most RNA extractions procedures yield RNA with minimal or no contamination with DNA that is suitable for applications such as northern blot constructions of cDNA libraries or microarray hybri ...

Background: mRNAs （messenger RNAs） comprise only a small percentage of all RNA species in a eukaryotic cell in Neurospora usually ~ 1-6 % （Lucas et al. 1977; Sturani et al. 1979）。 For some application ...

harvard大学Jeffrey K. Ichikaww编写的Human RNA Extraction protocol(哈佛RNA提取方法)。

细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。

用于基因芯片分析的细胞RNA的抽提:细胞培养结束后，若是贴壁细胞，可以用移液器吸去培养基，并加入3ml左右的PBS洗一次（需要注意的是从冰箱中取出的PBS缓冲液温度要尽量回复到室温，避免给细胞冷的刺激）。吸去PBS后，即可加入适量的Trizol试剂，Trizol的量一般是每10cm2的面积加1ml的Trizol；若是悬浮细胞，可以进行离心，吸去上层的培养液，加入适量的Trizol，一般是5-10×106细胞加1ml的Trizol。加入Trizol后，用移液器反复吹打细胞，使细胞充分裂解（见图1-图3）。判断Trizol加量是否合适的标准可以根据细胞溶解物的粘度来判断。在细胞刚溶解时，可以发现有丝状物出现，这是细胞的基因组DNA释放出来了，若Trizol量合适，吹打几次后，丝状物会消失，液体粘稠性下降；若Trizol量过少，丝状物往往一直存在，液体粘稠性大，可以继续补加Trizol。若Trizol的量过少，会导致抽提的RNA中有较多的基因组DNA污染。由于Trizol试剂中含有强烈的RNA酶抑制剂，因此细胞充分溶解在Trizol中后就不用担心RNA的降。