一、概述 前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。由于DNA一般都以双链形式存在 ...
一、概述 前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。由于DNA一般都以双链形式存在 ...
四、核酸探针的标记和检测 分子杂交是核酸链间碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法是放射性同位素标记。常用的放射性同位素有32P和35S前者能量高，信号强，最常用。放射性同位素标记探针 ...
五、核酸分子杂交的类型 随着基因工程研究技术的迅猛发展，新的核酸分子杂交类型和方法在不断涌现和完善。核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除 ...
五、核酸分子杂交的类型 随着基因工程研究技术的迅猛发展，新的核酸分子杂交类型和方法在不断涌现和完善。核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 由于固相杂交后，未杂交的游离片段可容易地漂洗除 ...
六、核酸分子杂交实验因素的优化 （一）探针的选择 根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。长的 ...
六、核酸分子杂交实验因素的优化 （一）探针的选择 根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。例如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。长的 ...
Transient Transfection of Cos-1 CellsNote: This protocol has been optimized for Cos-1 cells. Successful transfection of each cell type requires optimization of the basic protocol. Variables to consid ...
Chemical transformationPreparation of chemically competent cellsHave the following solutions at 0-4 deg C:a) 100 mM MgCl2b) 100 mM CaCl2-15% glycerolc) sterile GSA bottles and pre-cooled rotor1. Grow ...
Long Term Storage of Transformed E.coliTransfer 10 ml of 250 ml overnight culture in sterile flip-cap 15 ml Tube. Add sterile Glycerol to 15 % final conc. (i.e. 1.875 ml of 80% Glycerine stock solutio ...
The magic E. coli transformation protocolTake the ultra-competent cells out of freezer. Thaw on ice. Put your selection plates (LB +?) on the bottom shelf of an incubator to pre-warm them (about 37 to ...
pGL3 Luciferase Reporter VectorsThe pGL3 Luciferase Reporter Vectors provide a basis for the quantitative analysis of factors that potentially regulate mammalian gene expression. These factors may be ...
pGL3 Luciferase Reporter VectorsThe pGL3 Luciferase Reporter Vectors provide a basis for the quantitative analysis of factors that potentially regulate mammalian gene expression. These factors may be ...
TRANSFORMATION (ONE-STEP PEG METHOD)Dilute 1:100 a fresh O/N culture of bacteria into prewarmed LB broth and incubate cells with shaking (225 rpm) to an OD600 of 0.3-0.4. Add an equal volume of ice-co ...
Transformation of Competent CellsA. Preparing competent cells.Inoculate 30 ml of SOB broth in a 250-ml flask with bacteria to be transformed from a single colony on a fresh plate. Incubate overnight a ...
Transformation of E. coliReference: H. Inoue H. Nojima & H. Okayama Gene 96 23-28 (1990) 1. Culture E. coli in 250 ml of SOB medium in a 2-liter flask at 18 C with vigorous shaking until an A260 of 0. ...
Bacterial Colony PCRObjective:This protocol allows rapid detection of transformation success when primers are available to allow determination of correct ligation products by size or hybridization. Pr ...
Screening of recombinants It is best to do a test ligation without insert if the background is low it would not be necessary to screen colonies for insert.1) colony PCR1) Pick a colony from plate and ...
Stable Transfection (Electroporation)Outline:Electroporation can be used for both transient and stable transfection of mammalian cells. Cells are placed in suspension in an appropriate electroporation ...
基因组DNA Southern杂交1）基因组DNA Southern印迹的制备预备1．用适当的限制性内切酶消化基因组DNA样品（10μg）。2．进行琼脂糖凝胶电泳。一般用0.7～1.0％的琼脂糖凝胶分离基因组DNA，它在1～15kb的范围内有较好的分辨率，可选用TBE或TAE缓冲液。琼脂糖凝胶电泳需在1V/cm的电压下进行，如果要分离片段大小相似的DNA带，应用较大的凝胶（20×25cm）。常用的 ...
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