抗体抗原实验

噬菌体表面展示方式 目前在噬菌体肽库技术中，主要用于表面展示肽库的方式有两种：pⅢ蛋白展示方式和pⅧ蛋白展示方式。展示系统又可分为噬菌体表面展示系统和噬菌粒(phagmid)表面展示系统。 噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可展示外源多肽或蛋白质，在基因工程操作上基本相同：在信号肽与成熟蛋白质编码区之间有一个可以插入外源基因片段的克隆位点，插入的外源基因编码的蛋白与pⅢ和pⅧ以融合蛋白的形式 ...

噬菌体表面展示系统 1．噬茵体展示系统 噬菌体展示系统是在野生性丝状噬菌体的基因组基础上改造而成，保留了噬菌体完成整个生活史所必需的基因，包括感染宿主、DNA复制、包装蛋白质合成以及病毒组装的基因，还包含一个抗生素的遗传标记和一个多克隆限制性酶切位点。 噬菌体载体不需要辅助噬菌体，比较稳定。但由于DNA基因组大(相对分子质量为9 000～10 000)，回收DNA的产量低， ...

噬菌体肽库技术的特点 (1)在噬菌体表面展示的融合蛋白或肽直接有效地与其编码基因密切偶联在一起，因而在获得多肽的同时通过对噬菌体单链DNA插入DNA进行测序，从而得到了多肽的编码基因。 (2)库容量大(目前可达到1010)，选择范围广泛，可能筛选到针对某个生物大分子的新型特异性结合肽，甚至是自然界中不能天然产生的但具有高亲和力的配体分子。而且筛选到的多肽结构多样，为进一步分析研究蛋 ...

构建噬菌体肽库的密码子选择 要建立一定长度的肽库，首先就是要人工合成相应长度的核苷酸随机序列，理论上核苷酸序列随机性越大，则肽库的多样性就越丰富。如密码子采用NNN合成方式，理论上可以得到所有可能且完全随机的氨基酸序列。但实际上其中有很多序列因存在着终止子而得不到表达，因此要尽量减少终止子在核苷酸序列中出现的频率。终止子有3个：TAA、TGA和TAG，因此密码子的合成方式一般选择(NNK) ...

肽库的筛选方法 噬菌体肽库筛选总的指导思想是利用有些生物大分子之间存在着不同大小的亲和力，以生物大分子为靶目标，通过直接或多轮筛选可以从肽库中筛选得到相应的且具有特定亲和力的结合肽。噬菌体肽库筛选方法一般采用生物学筛选技术，又称为生物淘洗(biopanning)，即利用生物操作方法从噬菌体随机肽库中筛选出所需的噬菌体肽。筛选方法可以因筛选靶目标的性质、筛选的规模而不同，并且与操作人员的习惯 ...

编码15肽随机DNA片段的克隆 (1)M13KE载体的大量酶切 双酶切反应体系： M13KE载体(1ug) 2 ul H2O 32 ul 10XNE Buffer 3 4 ul EagI(10 U／ul) 1 ul Acc65 1(

以蛋白分子为靶目标的噬菌体肽库模拟抗原的筛选 (1)将单克隆抗体用包被液CBS稀释，加入酶标板，一般抗体包被浓度为10ug/孔，包被体积为100ul/孔，稍加晃动使孔表面变湿，置于4℃下包被过夜(或37℃慢摇孵育2h)。第二天倾去板中包被液，每孔加入200ul/孔洗板液(PBST05)，静置5rain，甩去洗板液，于无菌干净的滤纸上拍打，以尽量除去剩余的液体，重复洗5次，以下的洗板操作都与 ...

以蛋白分子为靶目标噬菌体肽的鉴定 (1)ELISA鉴定：用牙签轻触筛选到的并单克隆化的含噬菌体单菌落，将其投入已放有1m1 B-Kanl00-Tet40液体培养基的15ml试管中，37℃震荡(270r/rain)培养24h。离心除去菌体，得到上清液，即单克隆的噬菌体，可直接用于鉴定。将单克隆抗体用CBS稀释成一定浓度，以100ul/孔包被96孔酶标板，于4℃下包被过夜(或37℃孵育2 h) ...

以蛋白分子为靶目标的噬菌体肽库筛选的常规实验方法 (1)大肠杆菌KglKan的活化：用无菌接种针从菌种甘油保存液中蘸取少量菌液，划线接种于LB-Kan平板上，翻转平板，于37℃培养过夜；次日培养平板用石蜡膜封口后，在4℃中保存不超过1个月。 (2)大肠杆菌K91Kan感受态细胞的制备：取lmlLB液体培养基于15m1指管中，加入1ulKan(100ug/m1)，从培养平板中挑选大肠 ...

以细胞为靶目标的噬菌体肽筛选结果鉴定 (1)用细胞ELISA鉴定方法：分别将体外培养的肿瘤细胞和正常细胞进行消化、记数后制成相同浓度的细胞悬液。96孔细胞培养板中每孔加100弘1细胞悬浊液，使培养板上、下两个孔分别对应相同浓度的肿瘤细胞和正常肝细胞。37℃细胞培养箱中过夜，使细胞贴壁。每孔加入100ul 3％多聚甲醛固定，1h后用PBST―05、PBST―5分别洗板3次。每孔加封阻液(PB ...

体内噬菌体展示技术筛选肝癌组织特异性黏附肽材料与方法 旨在利用体内噬菌体展示技术，筛选与肝癌组织或细胞特异性亲和的短肽。一方面为临床研究肝癌的发生发展机制提供新的线索；另一方面，也可作为某种诊断、治疗制剂来影响和抑制肝癌细胞的繁殖和转移，减少肿瘤早期诊断的盲目性和治疗过程中抗癌药物对人体自身的损伤。最后由小分子多肽取代传统免疫毒素中抗体成分，大大降低传统单克隆抗体及其片段所造成的免疫原性， ...

体内噬菌体展示技术筛选肝癌组织特异性黏附肽结果1．荷瘤裸鼠肝癌特异性结合短肽的体内筛选 我们把原肽库中噬菌体注入荷瘤小鼠体内，经血液循环，回收肝癌组织中的噬菌体，扩增后作为第二轮筛选的起始物。用1011转导单位启动下一轮筛选过程，共筛选3次。筛选结果用柱形图表示。 三轮筛选中组织噬菌体回收率2．免疫组织化学结果 在第一轮筛选的荷瘤裸鼠各组织中，瘤、肝、脑3种组织出现阳性反应；第二轮筛选 ...

新型疫苗的设计与研制 疫苗的概念是200年前由英国医生爱德华・琴纳(EdwardJenner)首先提出。近代免疫学奠基人巴斯德(pastor)发明了第一种鸡细菌减毒霍乱疫苗，提出为动物接种相同的细菌可以阻止该菌感染的免疫接种原理，从而奠定了免疫理论基础。1949年恩德斯(Enders)发明了组织培养技术，为病毒类疫苗的研究与发明开辟了新的途径。近100年来，疫苗的开发和应用已成为医学科学的 ...

联合疫苗 联合疫苗即数种疫苗抗原联合制成的疫苗。联合疫苗的主要目的是减少注射次数的同时预防更多的疾病。其意义在于提高疫苗覆盖率和接种率，减少多次注射所带来的痛苦，减少疫苗管理上的困难，降低接种和管理费用等。但是必须考虑在联合疫苗中各抗原组分的可溶性、物理兼容性和抗原稳定性，联合疫苗必须避免一些潜在的问题如抗原竞争、表达抑制、不良反应加重等。目前常用的联合疫苗有白喉、破伤风、全菌体或无细胞百 ...

疫苗的分类(一)按疫苗原分类 1．减毒活疫苗 此类疫苗是将病原微生物(细菌或病毒)在人工训育的条件下，促使产生定向变异，使其极大程度地丧失致病性，但仍保留一定的剩余毒力、免疫原性和繁衍能力，如麻疹、风疹、腮腺炎疫苗等。 2，细菌或病毒灭活疫苗 细菌或病毒灭活疫苗是细菌、病毒或立克次氏体的培养物，经化学或物理方法灭活制成，便之完全丧失对原来靶器官的致病力，而仍保存相应抗原的 ...

结合现代技术研制的新型疫苗 1．基因工程疫苗 基因工程疫苗是用基因工程方法或分子克隆技术分离出病原的保护型抗原基因，将其转入原核或真核系统，由此表达出该病原的保护型抗原，制成疫苗，或将病原的毒力相关基因删除，使其成为不带毒力相关基因的基因缺失苗，如多肽或亚单位疫苗、颗粒载体疫苗、病毒活载体疫苗、细菌活载体疫苗、基因重配疫苗、基因缺失疫苗等。大量的候选疫苗同时预防的疾病因子包括包桑螺旋 ...

疫苗的主要成分 疫苗的基本成分包括抗原、佐剂、防腐剂、稳定剂、灭活剂及其他活性成分。疫苗抗原成分的免疫功能、免疫原性应该长期保持并有很好的稳定性，疫苗及其配伍剂在使用后不良反应越少越好。 1．抗原 抗原是疫苗最主要的有效活性组分，是决定疫苗的特异免疫原性物质。抗原应能有效地激发机体的免疫反应，包括体液免疫或(和)细胞免疫，产生保护性抗体或致敏淋巴细胞，最后产生抗特异性抗原的保 ...

新型疫苗设计的技术要求 疫苗设计是疫苗策略的基础，其目的在于通过对病原体及免疫系统的深入研究，以确定体液免疫或细胞免疫为主的方针，并辅之以细胞因子及合理有效的疫苗输送系统，从而达到最佳、最理想的疫苗设计。通常的疫苗策略应考虑以下几个方面。(一)抗原的选择原则 一个候选疫苗的选择是疫苗设计中最为关键的步骤，对所要研制疫苗的病原体的生物学结构、基因结构、生物化学、生物学技术性状、抗原特征 ...

核酸疫苗的免疫接种途径 DNA疫苗接种后所诱导免疫保护力的强弱取决于该疫苗的细胞转染效率以及在被转染细胞中的表达水平和维持时间。DNA疫苗接种的靶组织主要包括肌肉、皮肤、皮下组织和黏膜等。 (1)肌内注射：作为DNA疫苗接种的主要靶组织，肌肉组织具有血流丰富、转基因容量大、摄取外源DNA能力强、所表达的特异性疫苗组分可随血流播散等优点。同时，肌肉组织的肌纤维是有丝分裂后细胞，不会使 ...

核酸疫苗目的蛋白基因序列 1990年，Wolff等将纯化的DNA直接注射到小鼠肌肉后检测到目的基因的表达产物，此后Ulmer将带流感病毒的核蛋白基因质粒DNA注射到小鼠骨骼肌后，小鼠产生了良好的体液及细胞免疫反应，并对流感病毒有了一定的保护力。同年，Wang也报道了HIV的糖蛋白gpl60基因直接注射小鼠和非人灵长类，产生了免疫反应。这一系列结果引起各国学者的广泛关注。核酸免疫是将编码抗原 ...