微生物学技术

在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。

营养明胶成分蛋白胨5g牛肉膏3g明胶120g蒸馏水1000mLpH6.8~7.0制法加热溶解、校正至pH7.4~7.6,分装小管，121℃高压灭菌10min,取出后迅速冷却，使其凝固。复查最终pH应为6.8~7.0.试验方法用琼脂培养物穿刺接种，放在22~25℃培养，每天观察结果，记录液化时间。或放在36士1℃培养，每天取出，放冰箱内30min后再观察结果。

Hugh-Leifson培养基（O/F试验用）成分蛋白胨2g氯化钠5g磷酸氢二钾0.3g琼脂4g葡萄糖10g0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mLpH7.2制法将蛋白胨和盐类加水溶解后，校正pH至7.2.加入葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入指示剂。混匀后，分装试管，121℃高压灭菌15min,直立凝固备用。试验方法从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两支培养基，其中一支于接种后滴加溶化的1%琼脂液于表面，高度约1cm,于36±1℃培养。

糖发酵管成分牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠3g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2g0.2%滇麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mLpH7.4制法1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min.另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36±1℃培养，一般观察2~3d.迟缓反应需观察14~30d.

ONPG培养基成分邻硝基酚β-D-半乳糖昔（ONPG）60mg（O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）10mL1%蛋白胨水（PH7.5）30mL制法将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mm×75mm试管，每管0.5mL,用橡皮塞塞紧。试验方法自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于36±1℃培养1~3h和24h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生，则于1~3h变黄色，如无此酶则24h不变色。

西蒙氏柠檬酸盐培养基成分氯化钠5g硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2g磷酸二氢铵1g磷酸氢二钾1g柠檬酸钠5g琼脂20g蒸馏水1000mL0.2%溴麝香草酚蓝溶液40mLpH6.8制法先将盐类溶解于水内，校正pH,再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121℃高压灭菌15min.放成斜面。试验方法挑取少量琼脂培养物接种，于36±1℃培养4d,每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。

缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR和VP试验用）成分磷酸氢二钾5g多胨7g葡萄糖5g蒸馏水1000mLpH7.0制法溶化后校正pH,分装试管，每管1mL,121℃高压灭菌15min.甲基红（MR）试验自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中，于36±1℃培养2~5d,哈夫尼亚菌则应在22~25℃培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。甲基红试剂配法：10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。V-P试验用琼脂培养物接种本培养基中，于36±1℃培养2~4d.哈夫尼亚菌则应在22~25℃培养。加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL,充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36±1℃下培养4h再进行观察。

克氏柠檬酸盐培养基成分柠檬酸钠3g葡萄糖0.2g酵母浸膏0.5g单盐酸半胱氨酸0.1g磷酸二氢钾1g氯化钠5g0.2%酚红溶液6mL琼脂15g蒸馏水1000mL制法加热溶解，分装试管，121℃高压灭菌15min.放成斜面。试验方法用琼脂培养物接种整个斜面，在36±1℃培养7d,每天观察结果。阳性者培养基变为红色。

丙二酸钠培养基成分酵母浸膏1g硫酸铵2g磷酸氢二钾0.6g磷酸二氢钾0.4g氯化钠2g丙二酸钠3g0.2%溴麝香草酚蓝溶液12mL蒸馏水1000mLpH6.8制法先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加入指示剂，分装试管，121℃高压灭菌15min.试验方法用新鲜的琼脂培养物接种，于36±1℃培养48h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。

接种、分离纯化和培养技术：一、接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。1、接种工具和方法。在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图3-3）

微生物常规鉴定技术：形态结构和培养特性观察：1、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，新的细菌诊断技术和方法已广泛用于食品微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力，已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌学诊断方法，尤其是DNA探针和多聚酶链反应技术的发展和应用，明显提高了细菌的诊断水平。

随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，新的细菌诊断技术和方法已广泛用于食品微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力，已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌学诊断方法，尤其是DNA探针和多聚酶链反应技术的发展和应用，明显提高了细菌的诊断水平。

消毒和灭菌两个词在实际使用中常被混用，其实它们的含义是有所不同的。消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法，而灭菌是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。

一、目的基因的克隆（以pshuttle-CMV质粒为例）：1、选择适当酶切位点，进行酶切连接，将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。 2、重组质粒鉴定： 酶切鉴定或测序。3、重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。4、用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。5、胶回收线性化质粒，以备共转化 ...

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

进化是如何工作的——介绍（1）

在传统的分类鉴定中，微生物分类鉴定的主要依据是形态学特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应、对噬菌体的敏感性等。

沙门氏菌检验

食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法