免疫学技术

死亡受体家族与诱导细胞凋亡的外在通路 死亡受体家族的发现是与肿瘤的治疗密切相关的。早在1868年，人们注意到某些肿瘤患者在受到细菌急性感染时肿瘤会自然消退。后来，人们从细菌中分离到一种使肿瘤消退的毒素，即细菌内毒素(endotoxin)。用这种内毒素处理过的小鼠血液含有诱导肿瘤坏死的因子。1984年，Pennica首先克隆到编码这种血液因子的cDNA，即肿瘤坏死因子(tumor necro ...

生长因子与抗凋亡信号通路 生长因子(growth factor)是具有刺激细胞生长活性的细胞分泌蛋白。生长因子与细胞表面的生长因子受体结合引起多种细胞内信号通路的激活，最终导致细胞生长、分化、运动和抗凋亡等生物化学反应的发生。大量研究表明，生长因子及其受体的功能异常是肿瘤发生和发展的重要原因。最常见的生长因子配体和受体包括：表皮生长因子及其受体(EGF／EGFR)、肝细胞生长因子／离散因子 ...

细胞凋亡的分子生物学研究 20世纪90年代以来，随着分子生物学技术手段的日新月异，精密仪器设备层出不穷，推动生命科学领域的研究迅速进入到基因调控和蛋白激活及其引起的信号转导途径等微观变化，对凋亡的研究也更趋向于凋亡的分子机制和动态的过程变化。与此同时，20世纪肿瘤的研究在经历了70年代的癌基因时代、80年代的抑癌基因时代，到了90年代则进入了多基因，或者信号转导网络时代。正是在这一时期，大 ...

线粒体和凋亡 Mitchell于1967年提出了线粒体在氧化磷酸化过程中的作用，据此在1978年获得诺贝尔化学奖。此后线粒体的功能被定性为细胞的“动力工厂”，通过氧化磷酸化为细胞提供能量，因此不再受到重视。直到后来发现凋亡相关基因Bcl-2家族位于线粒体表面后，线粒体在凋亡中的作用又引起了广泛的关注，并且很快发现线粒体与凋亡的关系极其密切。凋亡诱导基因Bcl―2家族的不同家族成员与线粒体表 ...

凋亡与抗肿瘤治疗的策略 肿瘤的发生和发展是极其复杂的过程。个体差异、器官差异和致癌因素的差异都会对肿瘤的发生、发展和预后产生重要的影响。正是这一复杂性给肿瘤的治疗带来了很多困难。尽管对肿瘤发生和发展的机制尚未完全明了，甚至有争议，但是有一点共识便是肿瘤是恶性细胞“增生过度，凋亡抑制”的结果。肿瘤增生所产生的恶果显而易见：增殖过度的肿瘤压迫邻近器官，并造成侵袭和转移。凋亡是消除突变和损伤细胞 ...

Annexin V-PI双染法 在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是相对分子质量为35 000大小的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来 ...

使用显微镜通过形态学检测细胞凋亡 细胞凋亡的检测有定性或定量两类方法。定性可以通过形态学观察，包括光镜、电镜和荧光显微镜等，也可以通过琼脂糖电泳来检测特征性DNA梯形条带。定量研究的首选方法为流式细胞仪。原位末端标记法则既可用于定性，又可用于半定量。此外，相比荧光显微镜，激光共聚焦技术提供了更高的分辨率，并可以作一定程度的断层扫描，利用相应的软件可以把图像压缩成三维立体图形。荧光显微镜和( ...

p53基因的激活 p53是非常重要的抑癌基因。半数以上的人类肿瘤有高频率的p53基因突变或其他形式的功能失常。p53基因敲除的小鼠可发生多种肿瘤，进一步证实了p53基因异常与肿瘤发生和发展有密切关系。那么p53是如何抑制肿瘤发生的呢?p53被誉为基因组的卫士(guard“genome)。当DNA受到损伤时，p53基因被激活，导致细胞周期阻滞(cell cyclearrest)，并启动DNA ...

p53诱导的细胞凋亡在肿瘤治疗中的应用 肿瘤的化疗、放疗及生物学疗法是治疗肿瘤的重要手段。这些手段的主要机制在于利用化学药物、放射线或免疫制剂诱导肿瘤细胞发生凋亡，因而研究细胞凋亡在肿瘤治疗中极为重要。许多抗肿瘤药物或制剂如DNA交联剂、抗代谢药物和I／Ⅱ型拓扑异构酶抑制剂等都是通过激活p53来诱导细胞凋亡，但对p53突变的肿瘤则效果不甚理想。而紫杉醇主要针对突变的p53发挥作用。因此，针 ...

p53引起细胞凋亡的机制 作为转录因子，p53可激活上百种基因表达，这些户53靶基因直接参与细胞周期的调控、DNA损伤的修复，以及细胞衰老、分化及细胞凋亡的调控。发现p53靶基因对p53功能研究至关重要。cDNA差异显示技术和DNA芯片技术的应用对p53靶基因的发现提供了巨大帮助。目前发现的参与细胞凋亡调控的夕53靶基因已有数十种，可大致分为以下几类：死亡受体类，如Fas和DR5／kill ...

双苯咪唑类的Hochest-33342和33258及 JC-1染色双苯咪唑类的Hochest-33342和33258 该染料可渗透细胞膜进入细胞内，与DNA结合，使之染色。凋亡细胞对该染料的摄取增高，染色后呈强蓝色荧光。其实验方法如下。 (1)细胞培养及凋亡的诱导：将细胞接种在10cm的培养皿中(106细胞)，在适当的时机诱导细胞凋亡。 (2)收集细胞：悬浮生长的细胞可直接离 ...

细胞凋亡研究方法的应用 以下将说明如何运用上述研究方法探索p53诱导细胞凋亡的机制。大多数肿瘤细胞都有p53基因的突变或功能丧失。携带野生型p53的细胞中P53蛋白的水平很低，不足以引起细胞凋亡。因而，建立外源P53高水平表达的细胞系统对研究p53诱导凋亡具有重要意义。观察p53表达和激活引起的细胞生长停止或细胞凋亡，只能在p53基因可控表达细胞系中进行，如用四环素药物控制的p53表达系统 ...

DNA的片段化 (一)DNA梯形带 琼脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺(PAGE)电泳是分离、鉴定和纯化DNA的标准方法。琼脂糖凝胶的分辨率比聚丙烯酰胺电泳低，但分离范围广，可以分离200 bp一50 kb的DNA。细胞凋亡时染色体从核小体间断裂形成大小为180-200bp整数倍的片段，在琼脂糖凝胶中电泳后可呈现出规则间隔180-200bp的特征性“梯形带”。Jurkat细胞中p5 ...

芯片技术及其应用 生物学的研究由于基因组研究及计算机的发展进入了信息科学的时代，随着人类基因组计划的完成，获取了巨大的遗传基因信息，研究的重点逐渐转向后基因组领域。后基因组研究重点在于两个主要方向，即了解基因的功能(功能基因组)及巨大数目的基因组扫描(SNP)，这些信息对于人类研究、治疗、诊断和控制疾病具有重大的价值。基因结构、功能、表达调控及表达后作用机制与疾病的关系一直是医学中的热点， ...

生物芯片的主要种类 生物芯片虽然只有10多年的历史，但包含的种类较多，分类方式和种类也没有完全的统一。 1．根据用途分类 (1)生物电子芯片：用于生物计算机等生物电子产品的制造。 (2)生物分析芯片：用于各种生物大分子、细胞、组织的操作以及生物化学反应的检测。 前一类目前在技术和应用上很不成熟，一般情况下所指的生物芯片主要为生物分析芯片。 2．按照作用方式 ...

基因芯片的基本原理 基因芯片(gene chip)是目前生物芯片家族中最完善、应用最广泛的芯片，将许多特定的寡聚核苷酸或DNA片段(称为探针)固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交，利用碱基互补配对原理进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以用于基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面。运用缩微技术， ...

基因芯片的主要作用用于RNA水平的大规模基因表达谱的研究 由于基因芯片在固定介质和标记染料方面的优势，可以实现同一张芯片上多种荧光标记。利用双色荧光系统，可以在一张芯片上实现待测样本和对照样本靶序列的同时检测。基因芯片对于基因表达谱的研究就是利用了这一性质。将待测及对照两种组织的mRNA通过反转录分别用两种不同的荧光标记到两种组织的cDNA上，从而制备成探针，混合后与基因芯片进行杂交，两 ...

杂交测序(sequencing by hybridization，SBH) SBH概念的提出旨在发展一种快速、准确、高通量的测序方法，也是发展DNA芯片技术的初衷。它所基于的假设是完全匹配的互补探针捕获核酸的量最多、信号最强，捕获的核酸也是唯一的。将寡核苷酸探针固定到芯片上，待测样品中的标记DNA靶标与之配对，当配对的DNA有少至1个碱基的差异时，其Tm值的改变影响到杂交时的荧光信号值，从 ...

组织芯片 组织芯片技术又称组织微阵列(tissue microarray，TMA)，是近年来发展起来的以形态学为基础的分子生物学新技术，是一种高通量、多样本的分析工具。它是将数十个甚至上千个微小组织片整齐排列在一张载玻片上而制成的高通量组织切片，形成微阵列，将标记特定基因的核酸探针或抗体探针与之杂交，以检测该基因在不同组织中的表达情况。因此组织芯片是传统核酸原位杂交或免疫组织化学实验的集成 ...

基于基因芯片的酶反应方法 在ASO的基础上，又衍生出了一些基于基因芯片的酶反应方法，用于SNP的分析。与直接杂交法不同的是，基于酶学方法的基因多态性检测允许探针的3’端或近3’端设计突变碱基。一旦探针的3’端和靶基因序列互补，连接酶和多聚酶能够引导序列的延伸，这种特性可以用来区分不同靶基因的序列。这种方法被称为酶催化的延伸法，主要有引物延伸法和连接酶检测反应。基于这两种方法又发展了其他的基 ...