生物化学技术

　　不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1.在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量， ...

　　用第一套引物扩增15～30个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增15～30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子滤过器离心，在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用来分析中国仓鼠卵巢细胞AS52的分子突变。AS52细胞含有单拷贝的细胞gpt（guanine phos－phribosy tra ...

　　密码子具有兼并性，单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列是不精确的，但可以设计成对兼并引物，扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用兼并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变，但核苷酸的数量应相同。兼并度越低，产物特异性越强，设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，针对兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的扩增、克隆和序列分析。现已成功地克隆了猪尿酸氧化酶基因、糖尿病相关肽基因和哺乳 ...

（一） 构建重组腺病毒载体的目的 1. 增加外源基因的装载容量 我们知道，腺病毒有一定的包装容积限制，大约在75~105%，即28~40kb左右，若超出此范围则或是不能包装或是发生分子重排。以5型腺病毒基因组36kb计算，在不对腺病毒基因组作任何改变的情况下，腺病毒载体最多可以转运2.8kb左右的外源基因，这对于许多基因治疗方案来说是远远不够的。为了进一步地扩大腺病毒载体的应用范畴，有必要缺失其基 ...

如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题.基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。以下所述几条对于siRNA设计的成功极为重要。1. 从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这1 ...

增殖型腺病毒系统又称为肿瘤特异性增殖型腺病毒，多用于肿瘤的基因治疗。该载体利用肿瘤与正常组织及细胞间结构或代谢途径上的差异，使病毒可以特异性地靶向肿瘤细胞内复制、增殖，大量表达目的基因并最终裂解肿瘤细胞。以增殖型腺病毒载体作为肿瘤生物治疗的平台，可以充分利用腺病毒体积较小、弥散能力强的特点，与传统的复制缺陷型腺病毒载体比较有以下几个优点：病毒的大量增殖可以直接杀死感染的肿瘤细胞，并扩散到邻近肿瘤细 ...

在多重发光测试中，信号是同时产生，测试是独立进行。可以测试不同的发光动力学反应或不同的发射光波。可选择的是，反应也可以按顺序被促发，如商业化的Promega公司提供的Renilla和Firefly荧光素酶双报告基因试剂。双报告系统的原理如Figure 1b.双重分析的BL/CL分析采用连续的闪烁型（Flash）发光形式，如发光蛋白水母蛋白和acridinium-9-carboxamide标记。这种 ...

在较早的哺乳动物RNAi实验中，siRNAs是通过化学方法合成的，就像合成引物一样，是应用起来最方便的一种方法，研究人员几乎不需要做什么工作。但是RNA合成成本高，定制周期长，特别是有特殊需求的RNA序列。由于价格比其他方法高出很多，而且设计好的siRNAs中通常只有大约25%的siRNAs能高效抑制基因的表达（抑制效率80%），一个基因通常合成3—5对siRNAs ，这使得化学合成siRNA的成 ...

体外转录合成siRNAs，其成本相对化学合成法比较低，是一种相对性价比高的筛选siRNAs的好方法，而且要比化学合成法更快的得到siRNAs。一旦得到DNA 双链模版（这个还是需要DNA合成的，不过DNA合成的成本就比较低了），只要24小时转染，不需要等很久。在体外构建双链RNA时，分别在体外转录出正义和反义RNA，再将两者退火，形成双链RNA。体外合成的双链RNA可以用脂质体转入细胞中。但有些细 ...

其他制备siRNA的方法都需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个最有效的siRNA。而用RNaseIII降解长片断双链RNA成为siRNAs库就象制备一份混合有各种siRNAs“混合鸡尾酒”， RNase III的完全降解产物（12—15bp）同样可以诱导专一的基因沉默，效果与化学合成或者是酶法得到的siRNAs相当。该方法是选择200—1000bp的靶mRNA，用体外转录的方法制备长片断双 ...

目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括:1.化学合成 2.体外转录 3.长片断dsRNAs经RNase III 类降解 4.siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs 5.PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达 前三种方法经过体外制备siRNAs然后应用专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内转染或者电转染导入哺乳动物细胞；后两种方法则这两种方法的优点在于不需要 ...

利用NCBI可以查询不同物种间相对应的基因，如与小鼠相近的人类的基因：人和大鼠是做过全基因组比较基因组学研究的，UCSC做得最全全面，已有相关的paper发表。在UCSC的Genome Browser中，可以通过基因名查询人、小鼠、大鼠、鸡、猩猩、狗、斑马鱼、河豚这些物种之间的对应或相似的基因。也可以通过homologene 来进行查询：例题:找到跟人的p21基因相对应的大鼠基因.1. 进入ent ...

我们用BLASTx将手中的核酸序列到蛋白质数据库中进行比对。目的是想知道在氨基酸水平上我们的核酸序列和已发现的蛋白质有没有相似性。但是还有一个问题就是我们的核酸序列可能还找不到ORF，所以BLASTx就把所有的可能性都试一遍，也就将目的核苷酸序列翻译成六种 (目的序列的正负链各三种可能的读码框架) 氨基酸序列，这样我们就得到了六条氨基酸序列，然后再和数据库作比较。 有个序列 TCAATCGA ...

RefSeq NM_xxxxxx和GenBank Afxxxxxx看起来是重复的，但RefSeq和GenBank是分开的数据库，而且两者都是可以通过在Entrez nucleotide中输入各自的ACCESSION获得。开始时临时的RefSeq记录与GenBank记录非常相似。但是，当RefSeq记录被专家review以后，新增的序列数据、生物学注解、和参考文献常被加入。那时，RefSeq条目（即 ...

在用blastn搜索时，通过输入的核苷酸序列，我们会从数据库中得到最为接近的核苷酸序列。尽管我们已经在界面上选了相应的E值，仍然得到了E值不同的核苷酸序列。这是因为 E值代表被比对的两个序列不相关的可能性，E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了。 以下是英文解释，有兴趣的网友可以看看： E-value means " ...

先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，点击右边的“Links” ...

GENSAT database： GENSAT数据库目的是把小鼠各个发育阶段中枢神经系统的基因定位表达并给出图像结果；也就是可以看到不同发育阶段的表达的图像。 目前收集了三个发育期(embryonic day 15.5 (E15.5) postnatal day 7 (P7) and adult)。GENSAT本身是Gene Expression Nervous System ATlas的缩写。实 ...

Gene Ontology（GO）包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面功能信息，并将概念粗细不同的功能概念组织成DAG（有向无环图）的结构。Gene Ontology是一个使用有控制的词汇表和严格定义的概念关系，以有向无环图的形式统一表示各物种的基因功能分类体系，从而较全面地概括了基因的功能信息，纠正了传统功能分类体系中常见的维度混淆问题。在基因表达谱分析中，GO常用于提 ...

一、LOCUS在GenBank格式中，LOCUS NM_001469 2156 bp mRNA linear（家系血统） PRI（primate猿类） 16-DEC-2004DEFINITION Homo sapiens thyroid autoantigen 70kDa (Ku antigen) (G22P1) mRNA.The LOCUS field contains a number of ...

DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电 ...