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多重PCR

一般PCR仅应用一对引物,通过PCR扩增产生一个核酸片段,主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR(multiplex PCR),又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同. 多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物,某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原 ...

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免疫PCR

免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统.它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原,尤其适用于极微量抗原的检测.  免疫-PCR试验的主要步骤有三个:①抗原-抗体反应,②与嵌合连接分子结合,③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA).该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中,嵌合连接分子起着桥梁作用,它有两个结 ...

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琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围

琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35~600.61~200.70.8~100.90.5~71.20.9~61.50.2~312.00.1~2 ...

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聚丙烯酰胺凝胶孔径与DNA的有效分离范围

丙烯酰胺(%)有效分离范围(bp)溴酚兰二甲苯青3.5100~20001004605.080~500652608.060~4004516012.040~200307015.025~150156020.010~1001245 ...

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LCR

连接酶链反应(Ligase chain reaction,LCR),是一种新的DNA体外扩增和检测技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增.  连接酶链反应是Backman1997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明,并申报了专利.1988年Landegren也进行了该项研究.1988年Backman等又因分离热稳定的连接酶,而申报专利,1991年Backman和Barany分别用耐热DNA连接 ...

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自主序列复制系统

  自主序列复制系统(self-sustainedsequence replication,3SR),又称依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)或再生长序列复制技术.1990年Guatelli等首先报道了这一技术.NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序.该反应有赖于AMV逆转录酶,T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNas ...

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转录依赖的扩增系统

转录依赖的扩增系统(Transcript-based amplification system,TAS),是Kwen等人于1989年研究报道的,主要用于扩增RNA合成A、B引物,引物A的3'末端与待扩增RNA互补,其5'端有T7RNA多聚酶的启动子信息.逆转录酶以A引物为起点合成cDNA;引物B与此cDNA3'端互补合成cDNA第二链.逆转录酶除具有逆转录活性外,还有DNA多聚酶的活性及RNase ...

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Qβ复制酶反应

Kacian等于1972年首次报报Qβ复制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板的自我复制功能,它能在常温30min,将其天然模模MDV-1RNA扩增至109.1986年Chu等报道用生物标记的靶序列特异性探针,可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交,经洗脱未被结合的MDV-1后,再加入Qβ复制酶,扩增复制MDV-1拷贝,然后用溴乙锭染色检测或用同源性的第二探针杂交.  Qβ复制酶是一 ...

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直接裂解法提取制备模板核酸

标本(组织细胞,分泌物)加PBS或生理盐水离心洗涤后,加消化 裂解液20~50ul(0.5%NP-40和0.5%吐温-20),95~98℃,15~30min以裂解病原体, 裂解细胞.然后12000r/min离心5~10min,取上清20~30ul用于PCR扩增.血清标本可 直加等体积的消化液,加热处理离心后PCR扩增.亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液,95℃30min消化处理,离 ...

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碱变性法提取制备模板核酸

取血清20ul,加入1mol/L NaOH 20ul,37℃30min,离心,加 1mol/L HCl 20ul,离心后,取上清5ul,用于PCR扩增.亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L,37℃1h,再加HCL中和离心后取上清10ul做PCR,其特异性和敏感性较直接裂解法更好.

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碱变性法、煮沸法、碘化钠法提取制备模板核酸

碱变性法取血清20ul,加入1mol/L NaOH 20ul,37℃30min,离心,加 1mol/L HCl 20ul,离心后,取上清5ul,用于PCR扩增.亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L,37℃1h,再加HCL中和离心后取上清10ul做PCR,其特异性和敏感性较前法 更好.煮沸法经离心洗涤过的组织细胞,分泌物及血液标本,加适量无菌蒸馏水或PBS,混匀 后,100℃煮沸10~ ...

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异硫氰酸胍法

  异硫氰酸胍法提取制备模板核酸此法主要用于RNA的提取.标本为组织细胞及血清等.  1.异硫氰酸胍消化液  异硫氰酸胍4mol/L  柠檬酸钠(PH7.0)25mmol/L  十二烷基肌酸钠0.5%  β-巯基乙醇0.1mol/L  2.消化方法:用50~100ul细胞悬液及血清,加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀 后,或65℃1小时,或室温放置数分钟,然后加1/10体积的3mmol/L pH5. ...

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复合PCR

用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法称为复合PCR(Multiplex PCR)。这一方法最初是由Chanberlain 等检测人的基因发展而来。Bej等随之发展了对环境样品中不同属细菌相关基因序列同时PCR扩增的检测方法。两种不同的军团菌(legionella)基因,一为特异嗜肺L基因(mip),另一种为L-5SrRNA基因,通过引物摇摆(staggered)添加进行复合PCR。首先mip引物 ...

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玻片PCR

在聚丙烯管中可以对多种含膜板材料进行PCR,而在显微玻片上用组织细胞涂片或切片直接进行DNA扩增的方法就称为玻片PCR(Slide-PCR)。  先将细胞涂片或呈单层细胞,然后用甲醇/醋酸(3:1,V/V)、Carnoy溶液、无水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5~15min。用蒸馏水冲洗,干燥,直接使用或保存于-20℃备用。在玻片上划20mm×28mm为免疫组化反应区。加入30μl PCR反应混合液, ...

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DNA-PCR定量

用同位素标记的探针与电泳分离后的PCR扩增产物进行杂交,根据放射自显影后底片曝光强弱可以对模板DNA进行定量。Abbot等利用这种方法对人类T细胞白血病反转录基因进行了定量研究。  PCR扩增产物用专为检测ds-DNA而设计的微量荧光计定量,利用染料H33258专与双链DNA结合而使荧光增强50倍的特性。可以从标准模板系列稀释扩增产物量曲线上读出样品中模板DNA的量或拷贝数,达到PCR定量的目的。 ...

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mRNA-PCR定量

由于MRNA-PCR定量需经两个酶(RT和Taq)催化,因而影响因素较多。1989年Wang等报道了低丰度mRNA绝对定量方法。利用浓度已知且与待测靶mR-NA序列相同的内对照mRNA(其片段长短不同,便于PCR扩增后产物的分离),在同一体系中,用相同的由32P标记的引物与待测mRNA一同进行逆转录和PCR扩增,扩增产物电泳后,分别测定二者产物放射性强度,由预先制备的标准曲线推算出每个样本特异mR ...

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蛋白酶K消化裂解法提取制备模板核酸

蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理,尤以DNA样品为佳.如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿,粪便等.1.试剂配制  ①蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)  10mmol/LEDTA  150mmol/LNaCL  0.5%SDS  100~200ug/ml蛋白酶K.  ②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml, ...

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标记PCR(LP-PCR)

  LP-PCR(Labelled Primers PCR)是利用同位素、荧光素等对PCR引物5’端进行标记,据此检测目的基因的存在与否,与常规PCR相比更为直观,省去了限制性内切酶酶切及分子杂交等繁琐步骤,而且一次可以同时分析多种基因成分,因而特别适合于大量临床标本的基因诊断。目前该方法只对PCR产物进行定性鉴定。

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彩色PCR

  彩色PCR(Color complement assay)直译为“着色互补性检测”,是LP-PCR的一种,彩色PCR意译更为明确:它用荧光染料标记引物的5’端。荧光染料JOE和FAM呈绿色荧光;TAMRA呈红色荧光;COUM呈蓝色荧光。不同荧光标记的引物同时参加反应,扩增后的目的基因会分别带有引物5’端的染料,通过电泳或离心沉淀,肉眼就可以根据不同荧光的色泽判断目标基因是否存在及扩增基因的类型 ...

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锚定PCR

  锚定PCR(Anchored PCR A-PCR)主要用于分析具有可变末端的DNA序列,Loh等用A-PCR对人外周血淋巴细胞T细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA,并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个PolyG尾巴。Loh等恒定区与可变区连接部位设一个引物,另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的引物是一个固定点,它可以并与Po ...

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