蛋白质技术

相关专题 蛋白表达技术全攻略 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列它是基因表达不可缺少的重要调控序列.没有启动子基因 就不能转录.由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子. 原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成对mRNA的合成极为重要.在 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 一、大肠杆菌表达载体 大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。 1.表达融合蛋白的表达载体 当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法.植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上受噬菌体T7强启动子控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导.当需要表达蛋白时在细菌培养基中加入IPTG来启动表达.不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列在定位、检测或纯化目的蛋 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶此外还有一个操纵序列O、一个启动子序列P及一个调节基因I.I基因编码一种阻遏蛋白后者与O序列结合使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点.由P序列、O序列和C ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 GST融合蛋白的表达与纯化原理 GST 纯化系统是利用GST (glutathione-S-transferase )融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化 。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白，并可反复使用数次。试剂u IPTG(异丙基硫代-β-D ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 一、mtt比色法检测细胞活性 (一)原理 活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。 (二)试剂准备 1、青链霉素溶液(100X)：青霉素100万U，链霉素100万U，溶于100mlddH2O中抽 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 真核细胞常见表达载体 1. pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成， 在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 GST表达融合蛋白载体pGEX-KG大小：5006bp，氨苄青霉素抗性(Ampr)，IPTG诱导表达酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994GST分子量：构建pGEX-KG-Y ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 我想表达遇到的第一个瓶颈估计就是为什么我的外源片段插到载体里面，PCR鉴定没问题，双酶切也OK，可是就是不见表达。一般我们是如何判断没有表达呢?大多都是首先进行SDS-PAGE。在跑胶的时候一定要设对照，比较严谨的电泳对照，应该是：Marker，标准品阳性对照(如果有，且打算做Western的话)，以及空白载体( ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质――胰岛素。随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。而这其中大肠杆菌表达系统 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 很多朋友问这样一个问题：为什么毕赤酵母不表达? 他们自己也很纳闷，重组酵母PCR检测也证明目的基因重组了，但是诱导之后就是在表达上清中检测不到目的蛋白，仔细研究操作手册后仍然不知道原因。 本人，根据自己的经验，采用倒推的方法，按实验过程从后向前分析，供大家参考： 1、诱导之后表达上清中检测不到目的蛋白： 分析1： ...

相关专题 它们都是BSA生物实验中的封闭剂 1、BSA牛血清白蛋白在PCR中的作用是什么?它的作用机理是什么? BSA will coat the tube walls preventing the template from being absorbed. This will reduce the frequency of primer d ...

相关专题 想和大家讨论讨论原核表达载体 原核表达载体，如pet系列，型号从小到大，那么多，往往让新手选择起来不知所措。所以希望和大家讨论讨论到底他们是怎么演变的，每个的优缺点，是不是号越大的就越好等新手们往往困惑不已的问题。 希望下面的讨论分系列进行，如pet系列、pgex系列等 这篇文章是我从网上找的关于pet载体的介绍，只要你耐心的看完 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 如何做原核表达 之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。Novagen的母公司是德国默克(Merck)公司，它是 国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年 的历史。已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建 有62个生产基地。 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 本指南介绍了大规模和小规模GST蛋白表达和纯化的方法。由于蛋白的多样性，因此推荐先进小规模表达及纯化测试。 材料与试剂 1. IPTG (Sigma) 2. 咪唑 (Sigma) 3. 蛋白酶抑制剂 (Roche) 4. 溶菌酶(Sigma) 5. 谷胱甘肽 琼脂糖 4B 珠 (Pierce 15160) 6. ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。 分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA 克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA 序列具有异乎寻常的多样性(因 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 表达不同于其它一些实验，比如：提取质粒、PCR、电镜切片，这些人为控制的因素比较多，出问题相对来说也比较好分析。表达呢，你把质粒克隆好啦，交给细胞，然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。原核表达在表达当中来说还是比较简单，细菌培养条件简单、生长速度快，需要的仪器和培养基都比较便宜。当然，它也存在一些缺乏高级修饰、 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性(因而它是 ...

相关专题 蛋白表达技术全攻略 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。本文主要概述了 ...