蛋白质技术

Digestion of Proteins and Extraction of Peptides from an Acrylamide GelSherry Niessen Ian McLeod and John R. Yates IIIDepartment of Cell Biology The Scripps Research Institute La Jolla California.Exc ...

蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性，对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白 ...

蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。蛋白质提纯的总目标是设法增加制品纯度或比活性，对纯化的要求是以合理的效率、速度、收率和纯度，将需要蛋白 ...

在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂：　　1．盐析法 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。　　2．有机溶剂沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。　　3．等电点沉淀法 用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。　　4．非离子多聚体沉淀法 用 ...

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例 ...

主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、 ...

4. 滤纸、胶和膜的问题X. NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜怎样鉴别？解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能 ...

实验常见的问题指南根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：1.参考书推荐A.对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。2.针对样品的常见问题B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Wes ...

实验常见的问题指南根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：1.参考书推荐A.对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。2.针对样品的常见问题B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Wes ...

6. 染色的选择OO. Western Blot哪种染色好？解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但 ...

9. 条件的摸索 DDD. 用的是Santa Cruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否是我要的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上 ...

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（ ...

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（ ...

前两天做了一个western blot现在把试验中的一点小小的体会发上来，与大家交流，希望大家多多指点！1 本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较好。2 本人采用的是过夜封闭方法，虽然时间长，想想封闭效果应该是没有什么问题，但是一定要 ...

EDTA和Tris的混合液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM.可加入蛋白酶抑制剂提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。⑴ 匀浆 对于组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。⑵ 12000g离心，4℃，2min。⑶ 取少量上清进行定量。⑷ 将所有蛋白样品调至等 ...

前两天做了一个western blot现在把试验中的一点小小的体会发上来，与大家交流，希望大家多多指点！1 本实验室采用的脱脂奶粉已经存放了近两年了，虽然是四摄氏度保存，但是其封闭质量还是难以保证的。所以本人的试验结果中出现了小斑点。建议最好使用BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比较好。2 本人采用的是过夜封闭方法，虽然时间长，想想封闭效果应该是没有什么问题，但是一定要 ...

这是偶整理的蛋白裂解和提取的protocol，希望对大家有所帮助。10ml 三去污裂解液配方如下：50 mmol/L Tris-cl (pH 8.0)： 0.07882g 150 mmol/L NaCl： 0.08775g0.2 g/L叠氮钠： 0.002g 1 g/LSDS 0.01g100 mg/L Aprotin 0.001g10 g/L NP-40 0.1g 5 g/L去氧胆酸钠 0.05 ...

EDTA和Tris的混合液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM.可加入蛋白酶抑制剂提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。⑴ 匀浆 对于组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。⑵ 12000g离心，4℃，2min。⑶ 取少量上清进行定量。⑷ 将所有蛋白样品调至等 ...

这是偶整理的蛋白裂解和提取的protocol，希望对大家有所帮助。10ml 三去污裂解液配方如下：50 mmol/L Tris-cl (pH 8.0)： 0.07882g 150 mmol/L NaCl： 0.08775g0.2 g/L叠氮钠： 0.002g 1 g/LSDS 0.01g100 mg/L Aprotin 0.001g10 g/L NP-40 0.1g 5 g/L去氧胆酸钠 0.05 ...

WESTERN BLOT PROTOCOLIn a Western blot proteins that are separated on polyacrylamide gels on the basis of size are transferred to a membrane for detection with antibodies.Preparation of Human Cell Ext ...