蛋白质技术

设计具有很好折叠的大规模新型蛋白质库是最终能够产生具有工业及医学应用新结构及功能的蛋白质的有效途径。本章介绍一个极性/非极性氨基酸“二元组图”的蛋白质库设计方法，此方法整合了合理化设计和重组多样性。“二元组图”基于的前提是极性/非极性氨基酸残基的适当组合可以指导多肽链折叠成具有双亲性质的二级结构，此类二级结构可能“退火”形成所需的高级结构。设计的二元组图利用蛋白质二级结构中本身具有的周期性，使得每一个极性和非极性位点的侧链可以产生的组合变化。本章概述了如何利用二元组图法设计新型蛋白质库。

从培养的细胞和组织中提取总蛋白是实验室非常常见的实验步骤，从大多数类型的细胞和组织中提取总蛋白比较容易，但是从脂肪组织中提取高质量和高浓度蛋白质是非常困难的。脂肪组织有白色和棕色脂肪两种类型，被称为白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）。脂肪组织中含有许多脂滴，蛋白质含量小于细胞总数的 2%。低蛋白含量使得从脂肪中分离高浓度蛋白极具挑战性。以下是几种从脂肪组织中提取蛋白的方法：A.RIPA 缓冲液提取法：脂肪组织 ...

膜蛋白具有许多重要的细胞功能，对生物体存在至关重要。他们具有超过 60% 的药物靶点，占细胞总蛋白的 20%-30%。膜蛋白包括完整的膜蛋白，跨膜蛋白和外周膜蛋白。膜蛋白或者附着在脂质双分子层上或者通过疏水，离子或其他非共价与膜周边的完整蛋白结合。 使用表面活性剂进行质膜蛋白分离有可能破坏蛋白质-蛋白质相互作用，改变膜蛋白的拓扑结构。在一些下游应用中，例如膜蛋白 IP，Co-IP，酶检测，质谱分析实验，使用无表面活性剂的方法分离质膜蛋白 ...

在设计蛋白质库进行筛选时，在能够进行筛选的物理极限内我们必须尽一切可能产生出蛋白质变体的多样性。本章的目标是将概率的语言引入蛋白质工程实验中，进而来回答一些常见的问题。例如，我们怎样才能最有效地设计蛋白质库？我们最终从一个多样性完备的理论蛋白质库（简称理论库）中取样的比率是多少？错过理论库中一个个体的概率是多少？我们选择的变体中的突变是否具有统计意义，或仅仅是随机变异的产物？在整个蛋白质工程实验过程中这些计算标准可以使我们更好地设计和评价我们得出的蛋白质变体库。

位点特异核酸内切酶涉及核酸生物化学的许多方面。限制酶及相关酶已成为作用于 DNA 的酶的典范。通过理性蛋白设计，投入了无数的精力试图改变其特异性。但是，从整体上说，成功很少，大概是由于其识别能力高度冗余，并且识别和催化紧密地耦合。本章描述少数几个成功改变特异性例子之一，即转换错配修复核酸酶 MutH，当被 MetS 和 MutL 刺激的时候，此酶在半甲基化位点 d ( GATC) 切开一缺口——转化为切割全甲基化以及半甲基化和未甲基化 DNA 的变体。本章将描述此设计项目中所涉及的各种步骤，从对结构的分析和对负责感知甲基化状态的候选氨基酸残基的鉴别，到产生和鉴定针对半甲基化 d (GATC)位点具有不同特异性的 MutH 变体。

我们发展了用人纤连蛋白的第 10 个纤连蛋白类型Ⅲ结构域（FNfnlO)作为框架以显示用于与其他分子结合的多重表面链套的用法。我们把具有新的结合功能的 FNfnlO 变体称为“独体（孤体、单小体)”（FNfnlO 是一个由 94 个氨基酸组成的小蛋白质，它具有近似免疫球蛋白折叠的β三明治结构）。它是局度稳定的，没有二硫键或金属离子，它在细菌中高水平地表达为正确的折叠形式。这些期望的物理性质，使得 FNfnlO 框架与其他任何展示技术，事实上都可以比较。本章描述实物库构建和筛选以及独体的生产。

在 DNA 结合模体中，（Cys)2(His)2 类型的锌指模体具有大的操控潜力。为新的 DNA 结合蛋白设计，锌指模体提供了有吸引力的框架。特别是为产生新的、具有全新的 DNA 结合特性的，如长 DNA 链识别、DNA 弯折和 AT 富集序列识别——人造锌指蛋白，基于结构的设计技巧是特别有价值的。在此，基于最新的实验结果，描述为设计多重锌指蛋白以用于目标 DNA 序列识别、DNA 弯折锌指蛋白、（His)4类型的锌指蛋白和 AT 识别锌指蛋白的新技巧。

样品：重组胰蛋白酶，比活 4000USP u/mg pro.，上海雅心生物技术有限公司，纯度如图 1 所示。BAEE，Sigma.图 1. 重组胰蛋白酶的纯度的 SDS-PAGE 鉴定1. 最适温度的研究将底物 BAEE（0.25 mM）分别置于 4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 和 70℃ 水浴中温浴 20 min，加入相同体积的 RPT 酶液测定 rPT 的活力，结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。2. 温度稳定性的研究 取 10 mg/ml RPT 纯酶液稀释 10 倍后，分别置于 4℃、15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60 ...

样品：重组胰蛋白酶，比活 4500USP u/mg pro.，上海雅心生物技术有限公司，纯度如图 1 所示。BAEE，Sigma.图 1. 重组胰蛋白酶的纯度的 SDS-PAGE 鉴定1. 最适 pH 的研究准备 pH 为 3~12 的底物 BAEE（0.25 mM），分别测定 rPT 纯酶液的活性，最后结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。缓冲液成分依次为 25 mM NaAc-HAc (pH 3~6)，25 mM Tris-HCl (pH 7~8)，25 mM Gly-NaOH(pH 9~12)，所有缓冲液均为 25℃ 下配制。底物在 25℃ 温浴 10 分钟后，开始测活。2. pH 稳 ...

1、pH 稳定性将 rCPB 纯化后的酶液稀释至不同 pH 的 50 mM 缓冲液中 pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0，使酶液的终浓度为 1 mg/mL，25℃ 孵育 12 h 后测活。图 1 rCPB 酶液的 pH 稳定性2、最适 pH测定 rCPB 纯酶液浓度为 1 mg/mL, 在不同 pH 条件下的催化速率，底物浓度为 0.1 mM/L，pH 分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、7.65、8.0、8.5、9.0、10.0、11.0、12.0，pH3.0-5.0 用 50 mMNaAc-H ...

钙调素（CaM) 是普遍分布的蛋白质，参与钙介入的信号转导。当 Ca2+ 流入时，CaM 获得强亲和力，结合各种带有一个或多个CaM 识别序列的胞内蛋白，启动或终止 Ca2+ 调控的信号串联。通过对 Ca2+-CaM 复合物的核磁共振和晶体学结构研究，我们已得到对 CaM 目标识别机制的深入了解。一个最直接的应用就是，基于蛋白质的 Ca2+ 传感器。它使用了 CaM 复合物和绿色荧光蛋白，原先称为“chameleon”（钙变色子，英文原意为 变色龙——译者)。钙变色子的主要优点是，它们可以在单个细胞中表达，并以特定组织或细胞为目标，测量局部 Ca2+ 的变化。本章描述有关的方法，包括钙变色子的克隆、鉴定它们的生物化学和生物物理特征，以及用数字荧光显微镜在单个细胞中使它们成像。

虽然表观上简单，盘绕螺旋（coiled coil)模体是高度专一的，并在理解三级结构及其形成方面具有重要意义。最常观察到的盘绕螺旋形态——平行二聚态，其一般的结构类型仍有待全面的描述。尽管如此，其结构已呈现出在某些特定位置需要某些特定类型氨基酸的严格规则。本章我们基于现有盘绕螺旋结构，就应用这些规则到要设计或优化的盘绕螺旋结构来讨论这个系统。基于这些规则之上的理解和扩展，对这些模体的应用是关键的。因为，这些模体实际上在每个细胞过程中都起关键作用，它们通过屏蔽其他非天然的或不规则的蛋白质（如在肿瘤形成中跟盘绕螺旋结构域结合），作为药物投递试剂。我们讨论其结构中的 a 和 d 的 “疏水”核心位置以及 e 和 g 的“静电”边缘位置，在引导寡聚化和配对化的特异性作用。同样被讨论的还有那些在维持 a 螺旋倾向性、螺旋可溶性和二聚体稳定性上与 b、c 和 f 位有协同作用的位置。

氨基酸类似物的掺入越来越有用。非天然氨基酸的定点掺入，使得运用化学生物学对特定蛋白质的研究和应用成为可能。但是，非天然氨基酸的整体掺入也检验着蛋白质组和基因编码假定。例如，有机体对非天然氨基酸的适应可能会导致新的基因编码。为了理解和定量化这样的掺入引起的变化，需理解微生物学和蛋白 质组对非天然氨基酸掺入的反应。此文描述了在蛋白质组范围鉴定这些掺入效应的规程。

计算方法一直在蛋白质设计中发挥重要作用。本工作主要集中在搜索蛋白质序列空间，以找到一条或数条与已知结构和功能相容的蛋白质序列。在期望的功能和结构限制下，概率性计算方法为所容许的氨基酸变化范围提供信息。这样的方法可用于指导 建立蛋白质的单个序列或组合库。

原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acrylamide简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N，Nˊ-MethyleneBisacrylamide,简称Bis）,在催化剂核黄素或过硫酸铵和四甲基乙二胺的催化下，聚和而成的具有三维网状结构的胶。正常情况下蛋白的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。而在丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)，则蛋白的迁移率主要取决于蛋白大小，与所带电荷与形 ...

Preparation of Protein Extract1. Prepare extracts from cultured cells or tissues with our Trident Extraction Kits.The total number of cells per ml and the cell equivalent loaded per lane of gel should be optimized specifically for each protein and antibody.2. Determine the protein concen ...

蛋白磷酸化是多种信号转导途径中的重要环节，细胞内大部分重要的生命过程都涉及蛋白磷酸化。蛋白激酶很多，根据其底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类，可将它们分为 5 类，其中丝氨酸/苏氨酸 (Ser/Thr) 蛋白激酶又可分为以下几类。（1）蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）即 cAMP 依赖性蛋白激酶。全酶存在胞浆，被 cAMP 激活后，催化亚基可① 调节代谢；②调节离子通道；③调节其他信号转导途径的蛋白；④ 进入细胞核调节基因表达。（2）蛋白激酶 C 即 Ca2＋和磷脂 ...

无论是保存还是运输，请避免反复冻融。反复冻融，冰晶会破坏抗体和重组蛋白的空间结构，导致蛋白变性形成多聚体和重组蛋白构象改变，从而降低抗体的结合能力，也加快了抗体球蛋白和重组蛋白的降解速度。抗体和重组蛋白保存得当与否，直接决定了抗体和重组蛋白的活性使用效果，如果保存得当，Immune tech（苏州杰恩生物）的抗体和重组蛋白活性大部分都可以维持数年。1. 收到抗体和重组蛋白后的操作收到抗体和重组蛋白后（大部分抗体和重组蛋 ...

自噬是一种动态的、分解代谢过程。该过程中，溶酶体自我吞噬的方式对细胞组分进行分解回收。在酵母菌和哺乳动物细胞中，目前已识别的许多吞噬基因都与线虫门的秀丽隐杆线虫同源。近些年来，由 RNA 干扰（RNAi）和染色体突变导致的基因失活，早已被用来识别秀丽隐杆线虫的自噬功能，同时子啊多个生命过程中，自噬也表现出其所起到的重要作用。比如，对压力、寿命、细胞凋亡、细胞生长控制、易聚合蛋白的清除、胚胎发育过程中 P 颗粒的退化以及、细胞凋亡清除 ...

一、试剂准备1、Cas9 过表达慢病毒载体选择。 货号名称CR2001pLV-Cas9-PuroCR2002pLV-Cas9-NeoCR2003pLV-Cas9Nick-PuroCR2004pLV-Cas9Nick-Neo 我们现提供 4 种表达 Cas9 蛋白的慢病毒载体，您可以根据抗生素要求和基因敲除实验设计进行选择。1）抗生素选择：Puromycin 或 G418用嘌呤霉素筛选比较快，仅需 4-7 天即筛选出阳性细胞。G418 筛选需要 7-14 天左右。此外不同的 ...