蛋白质技术

1. 电泳图谱不齐或分离不良 这是电泳分析中最常见的问题，多数是由于血清滴加不均匀或滴加过多，也有因薄膜质量不合要求所致。点样这一步非常关键，一定要按操作步骤进行。首先选择质匀、孔细、染料吸附少的薄膜充分浸透缓冲液至湿度均匀无干白点。然后将滤纸吸去薄膜表面的多余水份，使薄膜含水量饱和均匀，这样才能防止薄膜表面液体含量不均，水份移动而引起标本移位。 点样前注意关闭门窗和风扇，因空气流 ...

一、原理 带电粒子在电场中向着与其自身带相反电荷的电极移动的现象，称为电泳。控制电泳条件（如pH 等），使混合试样中的不同组分带有不同的净电荷，各组分在电场中移动的速度或方向各不相同，从而达到分离各组分的目的，这就是电泳分析法。以醋酸纤维素薄膜作支持物进行电泳分析的方法称为醋酸纤维素薄膜电泳法。 在pH4.8 电泳缓冲液条件下，带有不同量磷酸基团的AMP、ADP、ATP 解离之后，带有负电荷量 ...

一、原理 血清中各种蛋白质的等电点大都低于pH7.0，在pH8.6巴比妥缓冲液中，它们均电离成阴离子，在电场中向阴极泳动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带电荷多少及分子大小不同，所以在电场中的泳动速度不同。一般所来，蛋白质分子量小而带电荷多者，泳动速度快，分子量大而带电荷少者泳动速度慢，因此可以利用其泳速不同将之分开。 血清中含有清蛋白、α-球蛋白、&be ...

火箭电泳实际是一种定量免疫电泳。其原理为：在电场作用下，抗原在含定量抗体的琼脂介质中泳动，二者比例在合适时在较短时间内形成状似火箭或锥形的沉淀线，而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系，因此本法可以测定样品中抗原的含量。 一、材料 1. 诊断血清（抗体）：抗人IgG或IgA免疫血清。 2. 待检血清（抗原）：人血清。 3. 参考血清。 4. &nb ...

免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离，然后于凝胶槽中加入抗体血清。使抗原抗体进行双向扩散，在比例适宜部位形成特异的抗原抗体沉淀弧线。 每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物，故可用抗原成分分析；且可以根据其迁移率与抗体所出现的特异反应进行鉴定。 一、材料 1. 待检标本（抗原）：正常人血清。 2. 抗体：正常人血清的家兔免疫血清。 3. 1.5%离 ...

对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法。此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性比双向扩散技术高10-15倍。 血清蛋白在pH8.6条件下带负电荷，所以在电场作用下都向E极移动。但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量又较大（为r球蛋白）。所以游动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。所 ...

琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。 如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散实验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳实验。 一 ...

当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。 一、材料 （1）免疫血清：免疫兔抗人血清。 （2）抗原：人血清。 （3）小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。 二、方法 （1）取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2ml，加入第一管，加时注意不能有气泡。 （2）以毛细吸管吸取生理盐水0.2 ml 加入第二管。 ...

一、IP前的准备工作： coIP：分为内源性蛋白的相互作用和非内源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之间以及外源拖内源蛋白）。 非内源性蛋白的相互作用，主要是通过过表达来实现，通常为简化实验、提高IP效率会让外源蛋白带上标签（tagged；这也是没有相应的可用于IP的内源蛋白抗体之前唯一可行的方案），因此就tag的使用而言存在很多小技巧。 1. His-tagged主要 ...

在从事细胞信号转导的研究过程中我们常常需要探寻新的通路。在纵横交错，纷繁复杂的cross-talk中如何筛选可能的路径是signal transduction领域永恒的话题，而免疫共沉淀技术则是常用而简便的方法之一。 1. 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）技术是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。它能确定两种蛋 ...

生物大分子的结构与功能的研究是了解分子水平的先象的基础。没有对生物大分子的结构与功能的认识，就没有分子生物学。正如没有DNA双螺旋结构的发现，就没有遗传传达传递的中心法则，也就没有今天的分子生物学。结构分子以由第一分子进入对复和物乃至多亚基，多分子复和体结构研究。 同时，过去难以研究的分子水平上的生命运动情况也随着研究的深入和技术手段的发展而逐渐由难点变为热点。蛋白质晶体学研究已从生物大分子静 ...

酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。 一、利用酵母双杂交 ...

基因组（genome）包含的遗传信息经转录产生mRNA，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA称为转录子组（transcriptome）。很显然，不同细胞在不同生理或病理状态下转录子组包含的mRNA的种类不尽相同。mRNA经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组（proteome）。同理，不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质的种类 ...

研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础。蛋白质—蛋白质互作网络是生物信息调控的主要实现方式，是决定细胞命运的关键因素。检测蛋白质间相互作用的实验方法有哪些？这些检测方法各有什么优缺点？总结如下。 一、生化方法 共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析（需要补充）蛋白质亲和色谱 基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时， ...

蛋白质-蛋白质相互作用图谱能对细胞功能和蛋白组机制提供有用信息。除了在线预测蛋白相互作用外，通过比较具有相对专一性语义关系的的两基因语义注释（Gene Ontology terms GO）的相似性，可以得到重建酵母蛋白互作网络图谱的新方法。为了验证这种方法的有效性，利用高置信蛋白互作标准数据校正确认。 由此种方法预测重建的蛋白互作网络含40753种互作关系，2259 ...

蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因 ...

一、免疫共沉淀和亲和层析共分离 免疫共沉淀是证明蛋白质-蛋白质相互作用的最直接最经典和最有效的方法，如蛋白A能与B相互作用结合成异源二聚体，无论用抗A或抗B的抗体或与A或 B的亲和物偶联的agarose小珠都能把A和B沉淀下来。因此广泛用于蛋白质相互作用研究。 常用的小珠： GST-Agarose（不需要抗体） ProteinA-Agarose(用时需加抗体) 基本方法： 1.表达蛋白质A 2 ...

一、Osprey 作者： Bobby-Joe Breitkreutz Chris Stark Mike Tyers 网址：http://biodata.mshri.on.ca/osprey/servlet/Index 编程语言：Java 操作平台：Window2000/xp/9x; LinuxUnix; 介绍：a network visualization system. A so ...

Western blot之歌 Western blot之歌 本视频来自 ...

材料 琼脂糖凝胶介质镍亲和柱 紫外检测仪 蛋白电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件 5 ml 注射器 0.45 μm 滤器 超声破碎仪 试剂 1. 结合缓冲液：20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH=8.0 2. 洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，不同梯度浓度的咪唑，pH ...