蛋白质技术

　　银染注意事项:1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。4. 染色过程中， ...

一、根据蛋白质溶解度不同的分离方法1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等 ...

首先，摆摆自己的经验。鄙人做WB有8、9年了，平均下来两天跑一张多的蛋白胶；文章嘛，凑数的单篇有上24+，一作单篇15+（系国内完成；注：当年的IF，现在逐年递减没个标准）。其次，由于一些机缘的因素，在实验室WB体系完善的过程中，很多靠自己摸索；说实话，碰了一鼻子灰，差不多能碰到的问题都经历了，因此我敢写这样一个咚咚给大家分享。再次，我再强调一点，对我们这类人来说，实验结果的可靠、漂亮已经不算一个 ...

1. *纤维素膜纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光(Luminol类)、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保 ...

文转载于丁香园站友dlzhangyu的论坛大作，点此查看详情，感谢dlzhangyu站友的分享。 2011年鄙人做western的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验，编辑了这份western blot操作步骤2012版，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献（原谅我无法像Endnote那样一一注明文 ...

除了个别在PAGE胶上利用荧光或者酶活性直接做类似Western反应的“前卫”方法，印迹法的常规主流，无论是Southern、Northern还是Western Blot，都需要将电泳结果转印到膜上固定，再进行显色显影反应。对于各种Blot来说，作为承载实验结果的载体，包括各类斑点杂交或者克隆转印，膜的选择就显得很重要。 德国老牌的厂家Schleicher & Schuell是世界第一个生 ...

我用的是罗氏TUNEL试剂盒，有哪位亲爱的师哥师姐知道蛋白酶 K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）配方的操作意思？蛋白酶 K工作液：10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8，怎么配啊？？？？ 答： ph 7.4： 0.2M 的Tris 25ml，再加42ml的0.1M的HCL即可 ph 7 ...

WB(western blot)实验，为分子生物学经典实验之一。常用来进行蛋白分子量估算，蛋白功能研究等实验。 在该实验中，需要进行一抗、二抗及荧光底物孵育等过程。常规情况下将经过转印的PVDF膜等于玻璃皿中或者杂交袋中与抗体孵育。但是，在玻璃皿中孵育，常常使用抗体的量较大，且抗体回收导致抗体的质量下降；在杂交袋中孵育，虽然使用抗体较少，但是常导致杂交袋和转印膜（PVDF膜等）的表面相互摩擦，导 ...

如何选择凝胶做分离纯化工作的人都知道，选择合适的填料是至关重要的。 1.测定------分子量、PI 当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。 2.选 ...

罗氏公司TUNEL细胞凋亡检测程序（In situ cell death detection kit-POD法）一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下， ...

注意：Label 溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。 反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。试剂盒组成：小瓶/盖子 1 蓝色 标签 酶溶液 内容物 大肠杆菌重组牛胸腺末端脱氧核苷酸转移 酶，在 storage buffer 中 10×conc. 5×50ul 在 reaction buffer 中的核苷酸混合物 1×conc. 5×550ul 抗荧光素抗体， ...

积层胶（或称浓缩胶）的作用原理？在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在pH6.7时很少解离，其有效泳动速率很低，而氯离子却有很高的泳动速率，蛋白质的泳动速率介于两者之间。加上电 压以后，作为先导离子的氯离子和尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性和电场强度成反比，这一区带便获得较高的 电压梯度，加速甘氨酸离子的泳动，使其赶上氯离子，建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳 ...

2.1 浓缩样品1、要浓缩的样品含盐量必须0.3M以上，含盐量低的样品须补加到0.3MNaCl。2、在内管（附有3KD膜）中加入500µl样品，将内管套入外管。3、对称放置离心管，14520rpm(即14000g)离心。（离心5min约浓缩2倍，10min约4倍，15min约6倍，20min约8倍，30min约10倍）。4、离心结束后，将内管倒置套在另一个干净的离心管呢，3880rpm离心min ...

苏木精-伊红染色方法，简称HE染色方法，是生物学和医学的细胞与组织学最广泛应用的染色方法。在病理学实验室中称为常规染色方法。病理细胞和组织学的诊断，教学和研究都是用HE染色方法观察正常和病变组织的形态结构。因此病理学工作者必需学习和掌握这种染色方法。 （一）HE染色的基本原理 1．细胞核染色的原理 细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸 ...

cOmplete His-Tag Purification Resin 灵活纯化蛋白、保证效能 选择靶蛋白适宜的缓冲条件 cOmplete His-Tag Purification Resin是一种新型的高效能IMAC基质，用于裂解液中His标签蛋白的一步法纯化，操作方便。采用罗氏特殊的镍螯合化学技术，该纯化树脂与常用的还原剂（如DTT ）、金属蛋白酶螯合抑制剂（如E DTA）兼容， ...

菜鸟摸索 在正文开始之前，请允许小妹我简单介绍一下个人情况，顺带为即将独自一人做此实验的xdjm们打打气。小妹我上无师兄师姐（上届师姐于我开始做实验时已毕业），下无师弟师妹（下届师弟师妹尚未开学），由于种种原因被老板发配到外院一个生物治疗中心进行我的实验。在我开始做Western时，制胶器及转膜仪等均未开封，老师们均表示以前也未做过Western。所以我是第一个吃螃蟹的人，吃苦或许是注定的。我自 ...

最近2个月都在做原核表达，刚开始什么都不会，连SDS-PAGE都跑成模糊的一片，其中的辛酸只有自己知道，现在实验慢慢上正轨了，自己也积累了一些经验。很怀恋之前探索的那段时光，现在把我做蛋白表达的过程和一些问题写出来，希望能够帮助开始做蛋白表达的人少走一些弯路。 1、表达载体的构建 构建表达载体是比较简单的，不过也是需要对你的蛋白还有所用的载体有一个详细的认识，对于比较大的蛋白最好选用能够助溶的 ...

泛素－蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system UPS）是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80%以上蛋白质的降解。本视频清楚地解析了泛素-蛋白酶体系统的作用及工作流程。泛素-蛋白酶体系统作用及工作流程 ...

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