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PCR技术(五):常见问题分析与对策

PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性,不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多, ...

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PCR技术(四):PCR污染与对策

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 一、污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染。 ...

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PCR技术(十一):PCR片段拼接的SOE和SDL方法

PCR技术(多聚酶链式反应)是现代分子生物学的一个巨大突破,它能在体外迅速、大量、灵敏地扩增基因片段。可是,经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效拼接,却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点,这不但操作繁杂,而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因拼接的新方法,即SOE和SDL法,就能巧妙地解决这个问题。 SOE法 1989年,Horton等人 ...

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PCR技术(十五):个体配子DNA序列的PCR分析

高等生物遗传图谱的构建依赖于选择性杂交后代的分析或者通过家系分析法来计 算连锁关系。对人类而言仅后者是可行的。使用长度多态性限制片段(RFLPS)在构 建人连锁图谱方面已取得长足的进步。为了对带有与已知表现型相关的RFLP标记的基 因进行定位,首先得建立间隔约10CM的遗传标记束(平均1CM等于1%重组),这样没 有基因离标记RFLP的距离会超过5CM。可靠的统计表明家系分析能够检测的遗传间距 精 ...

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PCR技术(十四):反向PCR

描述一种大聚合酶链反应(PCR)应用的方法,使在已知序列的核心区边侧的未知 DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA,以产生适合于PCR 增大小的片段,然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区的末端序列,但其方向性,使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。 这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列,还可应用于制备未知序列探针或测定边侧 ...

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PCR技术(十三):PCR用于进化分析

进化遗传学具有两个并列的研究方向:系统发育的重建和种群分析。自1962年,Zuckerkandl和Pauling提出蛋白质序列和基因序列的比较可以象分子种一样用于标志现存物种分化的时间以来,各种生化方法被用于系统发育的研究。在最初二十年内, 同功酶的电泳分析、免疫学比较和蛋白质序列分析被广泛地应用。而最近,DNA-DNA 杂交和核糖体RNA序列分析为分类学做出了重要贡献。这些技术大多有局限性,因为 ...

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PCR技术(十七):用PCR扩增cDNA库中的特异序列

最常用的基因分离方法需要建立组织或细胞RNA的cDNA库,然后用抗体或 DNA探针筛选出感兴趣的基因。虽然这个方法已成功地克隆了大量基因,但建立和筛 选CDNA库是一项非常耗时.费力的工作,而且用寡聚核苷酸作探针进行筛选需大量蛋 白质序列结构的资料。聚合酶链的反应(PCR)方法可使一种特异DNA扩增几百万倍, 并已成为分子克隆和诊断的十分有用的工具。最近,TAQDNA聚合酶的使用极大地简化 了PC ...

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PCR技术(十六):PCR产物测序

PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测 序技术相结合后,它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综 述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质 粒或病毒基因组相比,直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一个不依赖于生 物体(如细菌、病毒等)的体外系统,因而它更容易标准化(即例于自化2);对于每个待 测样 ...

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PYRO测序用于SNP基因分型

其实是一种段片段焦磷酸测序技术,在测序引物的引导下,完成段片段(含snp)的测序,从而实现基因分型。缺点:不能检测长片段,对于重复序列没有办法。 原理简介 1.测序引物与单链,PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶,以及底物APS和荧光素一起孵育。 2.四种dNTP之一被加入反应体系,如与模扳配对,此dNTP与引物的末端形成共价键,dNT ...

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SNP 检测方法及研究现状

SNP 是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性在群体中的发生频率不小于1 %。包括单个碱基的转换、颠换、插入和缺失等。所谓转换是指同型碱基之间的转换如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。依据排列组合原理SNP 一共可以有6种替换情况即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ ...

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新型的基因分型技术(SNP分型):巢式PCR-RFLP技术

随着生命科学迅猛的发展,与之相适应的实验技术手段越来越复杂和专业化,对于科研人员实验技能要求也越来越高。由于生物学实验高度的复杂性、使得一个科研人员往往只能精通某一方向的实验。因此许多生物技术公司应孕而生,他们提供了许多专业的服务,其中最常规的技术服务包括核酸、蛋白测序、引物合成,SNP分型动物培养及转基因动物实验。在国外,生命科学的研究已经初步形成了一个大型技术平台共享的研究形式,科 ...

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从RNA中提取mRNA的方法

从总RNA中分离mRNA 采用Promega公司的PolyATract® mRNA Isolation System III。使用该试剂盒,mRNA产量极低,因此下述方法是以Promega公司试剂盒操作手册为基础,并采用储昭晖硕士(作物遗传改良国家重点实验室植物分子生物学水稻分室)所建议的改进方法综合而成。 由使用者自备的材料 65℃水浴  无菌的、无RNase的1.5ml塑料 ...

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基于SNPs 研究的单倍型图谱计划

寻找标记SNPs 的国际遗传变异图谱计划,即国际单倍型图谱计划(Haplotype Map Project)已于2002年10月正式启动,2003 年中国承担了“国际单倍型图谱计划”10% 的任务,这表明我国基因科学研究能力的提高和在国际生命科学领域学术地位的提升。该计划的启动将为人类致病基因的寻找提供一条捷径。在DNA 上位置比较接近的很多SNPs,会组成单倍型块并作为一 ...

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SNP的检测知识

人类基因组中存在着广泛的多态性,最简单的多态形式是发生在基因组中的单个核苷酸的替代,即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms SNPs)。SNP通常是一种二等位基因的(biallelic),即二态的遗传变异,SNP的数量大、分布广,在组成人类基因组的30亿个碱基中,平均每1000个就有一个SNP。SNP作为第三代遗传标记,在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体 ...

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常见PCR检验筛检艾滋病毒问答集

一、请问PCR的检验一定准确吗? PCR检测艾滋病毒是利用截取病毒的ㄧ段RNA基因后,利用这段RNA进行复制(32次循环),得到大量相同的片段后进行检测。这个方法的最大好处是可以早期侦测是否感染,敏感性及特异性都非常的高。虽然这和每一个实验室的操作技术有关,但由于本所是采用全套全自动核酸萃取仪,及全自动核酸放大仪,也就是能将人为操作误差降到最低,是很准确的方法。 二、请问PCR的空窗期为多久?如果 ...

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差异显示技术(DD-PCR)及其应用

高等植物在其生命活动过程中,由于基因的选择性表达,决定了高等植物生命活动的多样性和连续性。在植物的生长、发育、衰老和死亡过程中,都有不同的基因起作用。因此,研究基因的选择性表达,掌握其对植物生命活动的调控,克隆新基因,是分子生物学的重要课题。 1992年,Liang和Pardee[1]首次提出差异显示技术(DD-PCR),并且利用这一技术克隆了几个基因。由于该技术具有快速、灵敏、简单和可分析低丰度 ...

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标准的PCR实验室简介

1.主体结构 主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝,从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固,线条简明,美观大方,密封性好。 2.标准的三区分隔和气压调节 将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区, 同时各区通过气压调节,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩 ...

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比较详细的PCR

1.PCR反应的最适条件 1.1 TaqDNA聚合酶 在早期进行的PCR反应中,使用的是大肠杆菌DNA聚合酶1的大片段,即Klenow片段。也曾有人用噬菌体T4 DNA聚合酶。这两种酶的共同弱点是对热不稳定性,DNA合成反应只能在370C进行。PCR时每一循环的解链温度都在90C以上进行,故在每两个循环之间要加入新的DNA聚合酶,使得整过程整个实验过程很繁琐和昂贵。同时在370C,引物与DNA模板 ...

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Troubleshooting for PCR and multiplex PCR

Troubleshooting discussion is based on the PCR protocol as described in the table below. All reactions are run for 30 cycles. ...

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The Polymerase Chain Reaction (PCR)

Raymond Dalgleish Department of Genetics Topics  • What is the Polymerase Chain Reaction?  • History and (pre-history) of PCR  • How PCR works  • Optimising PCR  • Fidelity er ...

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