PCR技术

一、免疫PCR 所谓免疫（Immune PCR）就是利用抗体与DNA特异结合来检测抗原，把抗原抗体反应与PCR联合应用而建立的一种抗原检测系统。 在免疫PCR中，一个中介分子同时具有与DNA、抗体分子特异结合的能力。其一端连接DNA（标记物），另一端连接抗原-抗体复合物，形成一个特殊的抗原-抗体-DNA连接物。作为标记物的DNA分子可用PCR的扩增，存在特异的PCR产物应证明作为标记物的DNA分子 ...

一、耐热DNA聚合酶特点 合理选择耐热DNA聚合酶是PCR成败与否的一个关键因素，如何选择最合适的耐热聚合酶，是进行PCR实验首先要考虑的问题。目前市面上有许多耐热DNA聚合酶，虽然名称各不相同，但主要区别在于特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度等几个指标。 TIANGEN公司生产的耐热DNA聚合酶全部采用标准化生产工艺和质量检测标准，是经过多次分子筛、离子交换层析柱纯化的超纯型产品，去 ...

一、实时荧光Taqman 探针设计 总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游 ...

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 (二)P ...

一 引物的设计 引物的设计对于这个实验至关重要，因为real time pcr的检测灵敏度比较高，所以相应的对引物设计的要求就很高。普通的要求规则大家都知道，还有几点必须注意： 1，引物的错配率（引物错配形成引物二聚体，但是SYBR照样能嵌入进去，结果导致实验结果的误差很大，重复性也不好）。 2，引物的特异性一定要高（不像常规PCR，引物同源性不高，只要两条产物的片段长度相差足够大，在电泳的时候能 ...

由多个实验室参与、Roche赞助的、研究LigntCycler和ABI PRISM real-time PCR仪性能对比的论文，发表在2004年Clinical Chemistry上（2004;50:1088-1092），SCI IF 5.454 点击下载 ...

High-throughput SNP genotyping by single-tube PCR with Tm-shift primers. Wang J Chuang K Ahluwalia M Patel S Umblas N Mirel D Higuchi R Germer S. Human Genetics Department Roche Molecular Systems Alam ...

1. SG浓度：　　终浓度1:5000－1:100000，一般为1:10000—1:70000 2. Primer浓度：　　终浓度50nM－300nM　　固定摸板浓度的梯度实验　　不加摸板的对照实验（NTC）——有无非特异信号　　熔解曲线的分析——是否单峰　　建议使用HPLC纯化的引物 3. MgCl2浓度　　降低MgCl2浓度以减少非特 ...

realtime PCR 在PCR体系中加有sybr green或者探针，普通的RT-PCR则没有。 realtime PCR上机后从电脑上直接读出结果，普通的RT-PCR需要跑胶、紫外线下观察结果或用凝胶成像系统分析。 realtime PCR一次测多种mRNA表达需要多色荧光，这就需要仪器支持多色荧光并且探针用不同荧光标记。普通的RT-PCR，可以采取双重PCR的方法同时检测2种mRNA表达。 ...

多聚集链反应（polymerasechainreactionPCR）技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR（real-timequantitativePCR）技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，本文就此技术及其应用做一综述。 1 实时荧光定量PCR ...

PCR除了是一个诊断工具外，更重要的是它有广泛的运用。PCR本身可直接用来鉴定特定基因的存在与否，也可以用来侦测基因是否有异常 (Gene mutation deletion and rearrangement…)。例如，在医学上对遗传疾病或肿瘤癌症的诊断及预后的评估； 对细菌、病毒及霉菌感染的诊断。它也可成为一个生产线进而大量复制特定的基因进行基因密码的读取 (DNA sequen ...

1、在骨肿瘤发病机理研究中的应用 骨恶性肿瘤是多种癌基因多阶段多途径协同作用的结果，到目前为止，发现与骨恶性肿瘤密切相关的癌基因有K-ras、c-fos、proα-1、proα-2、c-sis、c-raf、 c-myc、met、mdm2，抗癌基因有Rb、P53、P16等。发现的癌基因已有100多个，抗癌基 因有8个，它们当中究竟还有哪些与骨恶性肿瘤发生发展有关，仍有待于进一 ...

骨肿瘤诊断需要解剖学、组织学和胚胎学等基础知识，对病变需认真观察，仔细分析，但更重要的是对临床资料及X线所见要特别重视。骨肿瘤形态变异较大，而临床X线观察较全面，病理镜检有一定局限性，而一些癌基因改变是与某一型骨肿瘤密切 相关，即为肿瘤特异性基因，因此在骨肿瘤诊断方面在坚持临床、X线及病理三结合 的诊断原则基础上，通过PCR技术对肿瘤特异性癌基因变化的检测，可以更好地辅助骨肿瘤的诊断，具有其它方法 ...

癌症为基因突变造成的疾病，是由于细胞生长、分化及分裂繁殖等有关的基因产生病变所造成的。这些基因包括促进细胞分裂及繁殖的致癌基因，抑制细胞分类及繁殖或促进细胞分化的抑癌基因。当致癌基因过度活化或抑癌基因不活化而使细胞分类繁殖不受控制时，细胞就渐渐进入癌化的过程。因此癌细胞常包括有多个基因的突变，而不同的癌症又有不同的基因病变。如慢性骨髓性白血病会产生BCR-ABL的病变基因；又如以消化系肿瘤而言，大 ...

real-timeimmuno-PCR1992年，Sano等人将免疫测定技术与PCR结合，创建了一种全新的极其敏感的抗原分子检测技术，即免疫-PCR（Immuno-PCR），随着这种技术的不断发展，2000年，Sim等使用荧光定量PCR代替普通PCR，发展了免疫定量PCR技术（real-timeimmuno-PCR）。该技术把抗原抗体反应的高特异性和聚合酶链反应的高敏感性有机结合起来， ...

The polymerase chain reaction PCR using a heat-stable polymerase and suitable primers to direct the amplification of the desired region of DNA. is a rapid inexpensive and simple way ofcopying specific ...

一、样品处理 DNA是染色体的主要组成部分，是PCR的扩增模板。要进行PCR，研究DNA结构与功能或者用于诊断目的，首先必须从生物体内提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在，其分子量大（人的染色体DNA平均大小为3.0×109bp），提取DNA应尽量保持DNA完整性和纯度，即在提取中尽量避免机械张力引起的DNA分子降解，又要注意杂质及蛋白的去除，防止胞内酶解DNA。因此，提取DNA的基 ...

典型的PCR操作 在此处仅列出—般PCR操作过程，具体影响因素的优化将在本章第二节讨论，每一个具体操作前都需进行必要的优化。 一、 试剂 (1)引物根据待扩增DNA不同，引物亦不同，引物的设计见本章第三节。 (2)耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温(93—100c)，不同耐热DNA聚合酶的特性详见本章第4节。 Perkin—E1mer&m ...

1、逆转录PCR(RT-PCR)用来扩增RNA的方法。 2、竞争逆转录PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低丰度RNA定量的好方法。 3、多重PCR（multiples PCR）在同一PCR体系中加入多对引物可用于基天长度很长，发生多处缺失的检测。扩增同一模板的几个区域。 4、多种PCR可同 ...

PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’&ra ...