PCR技术

（一） 免疫PCR技术的概念 免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，再用PCR方法将这段DNA扩增，然后用常规方法检测PCR产物。 免疫PCR集PCR的高灵敏度与抗体和抗原反应的特异性于一体。其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检出浓度低至2ｎｇ/Ｌ的抗原物质，为现行任何一种免疫定量方法所不及。 （二） 免疫PCR体系的组成 免疫PCR体系 ...

1)克隆PCR产物的最优条件是什么？ 最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液 50ng质粒DNA1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。 ...

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤：(1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链；(2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DN ...

分子生物学技术正以惊人的速度发展，特别是近20年来已经成为生命科学的一个主要的生长点。1976年cDNA克隆技术的建立，使分子生物学更加迅速广泛地渗透到医学各学科，发展了各学科的分子理论基础。1985年Mullis首先描述的多聚酶链反应（PCR， Polymerase Chain Reaction ），使一向昂贵、繁杂、严格的分子生物学试验能够在比较简易、经济的条件下有效的开展，是基因分析技术的一 ...

聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products PCR-SSCP）是近年来发展起来的一种基因分析方法。&nb ...

在分子生物学研究中基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列，TAIL-PCR又叫热不对称交错PCR，能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。 TAIL-PCR技术简单易行，反应高效灵敏，产物的特异性高，重复性好，能够在较短的时间内 ...

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。 一、污染原因 （一）标本间交叉污染：标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染；标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。 ...

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用 ...

下游应用为基因筛选、测序、突变检测和分子诊断等等的用户，对PCR保真性要求很高。 降低PCR扩增的错误率可以通过使用各种具有高保真性的DNA聚合酶来实现。 DNA聚合酶的保真度用错误率来表示，包括碱基错配率、PCR产物突变百分数等。 在目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中，Pfu酶的出错率最低，保真度最高（见附表）。 除对酶进行选择，研究者也可通过优化反应条件来进一步减少PCR突变率，包 ...

引物 引物设计：引物长度适当，18-24mers，并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但长度大于24核苷的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低特 ...

Primers: i) Oligonucleotide primers are generally supplied as "so many OD units/ml" - but what does this mean in terms of mg/ml or mmol/ml etc? Given: a primer is Y nucleotides (nt) long; ...

Nucleotides: Stocks of nucleotides for PCR (or other procedure) are NEARLY ALWAYS dNTPs (deoxynucleotides) and concentrations is almost always given in EACH dNTP: that is the given concentration is E ...

临床基因扩增实验室采用PCR技术用于临床基因诊断，由于PCR技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污染导致临床检测标本假阳性结果；另外由于PCR技术要求高、影响因素多（特别是RNA标本），实验过程处理不当易导致核酸模板无扩增现象，导致临床标本假阴性结果。因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是PCR技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。 PCR实验室验收准 ...

PCR的假阳性问题深受重视，但我个人认为PCR假阴性问题相对于临床检测更为严重。其实PCR假阳性的问题是比较单纯的，一般仅涉及污染和引物的非特异性问题。而污染可以通过严格的实验室管理，合理的环境设置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解决，而引物的非特异性问题基本属于厂家试剂质量问题。而PCR的假阴性却不同，它涉及了与PCR实验的几乎所有人员和技术环节，十分复杂。就临床而言，大三阳检出率低、甚至于GC ...

在任何一项分析中，我们都可以看到用同一种方法分析，测定同一样品，虽然经过多次测定，但是测定结果总不会是完全一样，这说明测定中有误差。为此我们必须了解误差的产生原因及其表示方法，尽可能地将误差减小到最小，以提高分析结果的准确度。 一、准确度与误差 准确度是指测得值与真值之间的符合程度。准确度的高低常以误差的大小来衡量。即误差越小，准确度越高；误差越大，准确度越低。 误差有两种表示方法—& ...

摘　要：　运用mRNA反转录差异显示技术可以了解不同细胞或同类细胞在不同发育阶段、不同生理状态下的基因表达状况，为研究生命活动过程提供重要信息。文章对差异显示反转录聚合酶链式反应技术的基本原理优点与缺点以及近年来对该技术涉及的RT-PCR方法、引物设计、PCR反应参数、电泳及差异条带的显示方法以及杂交方式进行了论述和评价，并对其应用前景进行了简单分析。 关键词：反转录差异显示PCR；反向nort ...

反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究. 反向PCR的目的在于扩增一段已知 ...

微卫星（microsatellite analysis）即短串联重复序列(Short tandem repeat，STR)，它是由2-6bp重复单位构成的DNA序列，通常扩增获得的多态性长度片段范围在100-400bp之间。STR基因座广泛地存在于哺乳动物基因组中，以人类基因组为例，平均每15-20kb就存在1个STR座位，据此估计整个人类基因组中大约有50000-100000个STR ...

1、凝胶电泳分析 PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。琼脂糖凝胶电泳通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用；聚丙烯酰胺凝胶电泳时，6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分 ...

1.定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？ 按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。 ...