PCR技术

Welcome to MethPrimer MethPrimer is a program for designing bisulfite-conversion-based Methylation PCR Primer. Currently it can design primers for two types of methylation mapping PCRs: 1) Methylation ...

Application: Quantitative RT-PCR is used to quantify mRNA in both relative and absolute terms. It can be applied for the quantification of mRNA expressed from endogenous genes and transfected genes of ...

RT-PCR Analysis Solutions10X RT Buffer10X PCR Buffer100 mM Tris pH 9.0500 mM KCl1% Triton X-10025 mM MgCl2 use at a concentration of 1.5 mMLysis Solution4M GuSCN 250 g guanidine thiocyanate25mM Na cit ...

RT-PCR Analysis Solutions10X RT Buffer10X PCR Buffer100 mM Tris pH 9.0500 mM KCl1% Triton X-10025 mM MgCl2 use at a concentration of 1.5 mMLysis Solution4M GuSCN 250 g guanidine thiocyanate25mM Na cit ...

本文讨论的范围包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR。本文不谈具体protocol，是因为各种书籍和kit说明书上都有，主要说一些原则，而且大部分是失败和成功的经验，还有小组讨论结果以及各种书里七零八落看的内容，希望对大家有用。 基因表达的定义：说到基因表达，是指RNA，还是蛋白？是指mRNA还是包括风头正旺的非编码RNA？mRNA还有不翻 ...

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2 浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须 在RT时，引物 ...

SSCP原理：sscp称为单链构象多态性，它是基于DNA构象来检测PCR产物单链碱基微小差异的方法，因其检测敏感，快速和所需装置简便而在分子生物学各个领域广泛应用。但该方法的试验结果受多种因素的影响，如：PCR产物，温度，电压，PAGE胶的浓度和交联度等，因而重复性比较差。因此在做SSCP时要注意各种条件的一致性。如果有酶切位点的话最好用RFLP方法检测DNA 多态，或是用SSCP与RFLP两种方 ...

SSCP原理及特点 日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性 ...

生物试剂库：试剂库：http://www.bioon.com.cn/reagent/ 超过20万种试剂产品，包括化学试剂，分子生物学试剂，细胞生物学类试剂 PCR系列栏目：PCR/RT-PCR/qPCR PCR方法相关产品:核酸酶 聚合酶 反转录酶限制性内切酶 PCR克隆试剂盒 常用克隆载体 克隆试剂盒 AFLP分析 SNP基因分型 RACE试剂盒 SAGE 试剂盒 电泳设备 紫外设备 普通PC ...

1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向 ...

PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。 　　一、温度循环参数　　在PCR自动热循环中，最关键的因素是变 ...

PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高 模板核酸的产量. 　　传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏 ...

Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是 一种嗜热真菌，能在70～75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的. (一)酶活性与热稳定性　　该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70℃延伸率 ...

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生. 一、污染原因　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污 ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失 ...

PCR技术自1985年建立以来，发展之迅速、应用之广泛，表明其具有强大的生命力.近些年来，基于PCR的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对PCR技术进行研究和改进，使PCR技术得到了进上步地完善，并在此基础上派生出了许多新的用途. 原位PCR技术　　原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项 ...

生物界的丰富多彩很大程度上取决于严格调控下的基因的选择性表达。高等生物的细胞内约含有105个不同的基因，而主 基因在某个特定的细胞中，只有占15％的一小部分表达。而且在不同的细胞中，选择性表达的基础也是不同的。正是这些基因的选择不同决定了整个生命的过程：如细胞的生长分化，激素和细胞困子对细胞的作用、细胞周期的调控以及衰老、死亡等。和细胞的正常生理一样，一些病理的反应如肿瘤等也是由基因表达的改变引起 ...

一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：　　通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校读活性（3'-editing-exonuclease），可以将每个循环中碱基的错配率由1undefined-4降到1undefined-3，从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klent ...

平端连接　　通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5―10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于 ...

凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种. 一、琼脂糖凝胶电泳:　　琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度， 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连 接等.(一)凝胶浓度　　凝胶浓 ...