PCR技术

以下是我在网上查到的有关RT-PCR的资料,同丁香园的战友共享,希望对这方面实验的战友有所帮助!RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设 ...

请大侠帮忙看一下用下列两引物进行PCR扩增有没有可行性上游引物：5'-GCCAGACTGGGAAGAAATCTG-3’下游引物：5'-TGTGTTGGAAAATCCAAGTCA-3’基因序列：　　1 aggcagtgga gccccggcgg cggcggcggc ggcgcgcggg ggcgacgcgc gggaacaacg61 cgagtcggcg cgcgggacga agaataatca tgggccagac tgggaagaaa tctgagaag ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时 ...

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。3.引物GC含量 ...

在进行荧光定量PCR实验中，Ct数值非常重要，因为通过对标准物质进行定量PCR实验绘制出标准曲线，进而利用标准曲线法求出未知样本中的起始拷贝数。目前定量PCR仪器采用的是最大二阶导数法和样点拟合法计算Ct数值，其原因为实际工作曲线并没有相应的函数所能准确对应，因而采取以上两种方法。这里我举例说明一下使用样点拟合法计算Ct数值并进一步求算出起始拷贝数的过程。y = 4.416x - 80.128 当y=1.64 时 x=18.52y = 2.368x - ...

怎样选出最合适的Taq酶随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。目前市面上有多种Taq酶，能够满足多方面的实验需要。那么，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指标，如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等，我们在这儿将主要的Taq酶归归类，其性质、用途也就一 ...

小妹从文献上找了一对引物，各种条件几乎都摸了，都出现二聚体，P不出来，请各路大哥指点迷津，引物是否可用。引物序列如下上游序列：5’-TGA CCC ACT TGC CAC CCG TGC-3’ 下游序列：5’-GCA GCA CCC CAG GGC TGG C-3’酶切位点为825，,PCR产物268bp。基因序列为 1 ccacaatagg ggcagacctg tccatccttc tctgtgggtc ccctgtacct ttctccccca61 acaggatcag acccagaggc agc ...

基因序列如下：1 ctcctg gtgcaatgga gcgagtatta aaggtctttc attattttga aagcaatagtgagccaacca ccgaccactgtg agcccgcggc gtgaggcgtg ggaggaagcg cggctgctgtcgcccagcgc61 cgccccgtcg tcgtctgcct tcgcttcacg gcgccgagcc gcggtccgaa gtcttgctgt121 gtcacccagg ctgccagg ...

厦门大学第三届“荧光PCR－基础与应用”研习班通知（2008年11月30日—12月6日，厦门）实时荧光PCR以特异性强、灵敏度高、定量准确、全封闭等优点，已成为基础生物学研究的重要平台技术，正成为临床诊断新一代标准技术，广泛应用于传染病、遗传病、肿瘤等领域。为使广大一线工作人员全面掌握该技术，同时熟悉该领域的最新进展，厦门大学分子诊断实验室在2004、2006年成功举办两届研习班并获得广泛好评的基础上，再次携手国外实 ...

我想要的是大鼠GAPDH的一对引物，做内参用。blast出来那么多similar，能用吗？引物序列AGTTCAACGGCACAGTCAAGGantiCGCCAGTAGACTCCACGACATSequences producing significant alignments: (bits) Valuegi|22857817|gb|AC122039.4| Mus musculus BAC clone RP24-432H... 44 0.013gi|38089166 ...

高手来了啊 欢迎 多谢 帮忙看下我的这3条引物， 想选2 条。将用的是3‘RACE法 扩未知序列用的PRIMER 5 刚入门， 希望得到大家的帮助 给点意见 哪2条好呢？还是有什么缺陷， 要另设计？谢先了啊我的引物5' GTGAGAAGTTCCGTTATGC 3' seq no 67 ,length 19, Tm 50 ,GC%47.45' CGAGGAGGGAGAGGAAGAATAAACG 3' seq no 209,length 25, Tm 66 ,GC%525' CACGAACCACCAAAAAAACCCAACC 3' seq no 241 ,leng ...

最近在做一批细胞，打算要做PCR，因此引物设计这关逃不过了。beta 2 (TGFB2)、TGF A、VEGFC、VEGI各位同仁，我通过向两个老师请教设计了两套引物，方法如下。待各位同仁哪一种方法比较好。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。设计原则：引物与模板的序列要紧密互补。引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。引 ...

基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中 所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技 术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组DNA技术 的运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于 于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打 点．S－1核酸酶分析和RNA酶保护研究。这里描述 ...

声明 ：本帖转自小木虫生物论坛 全文如下近看到很多人求关于分子克隆方面的视频，本人原来发的一个帖子也不怎么好用了，好像是纳米盘的问题，现再次把总结的视频发到网上，希望能给大家提供方便。（视频可以下载观看，本人亲测）感受态细胞的制备 http://u.115.com/file/dn6iwyka载体质粒的制备及鉴定 http://u.115.com/file/dn6iwx69染色体DNA的酶切与电泳鉴定 http://u.115.com/file/ ...

——从RNA提取到荧光定量PCR完美解决方案从RNA开始到基因定量PCR的研究，已经开始成为一条经典的实验流程，其在科研、临检、进出口检验、公安系统等多种领域的应用越来越广泛。不过由于RNA提取以及荧光定量PCR实验的灵敏度和特异性要求，使得这一实验方案在实验操作、实验设计以及实验数据分析方面，对于实验人员的要求越来越高。TIANGEN公司根据多年在这一领域的研发经验，给客户提供一套规范的“从RNA提取—RT— ...

今天发现了一个很好的网上PCR引物银行：http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/里面有超过18万种引物序列，你只要输入基因针对的ID号（可以通过NCBI查询），这样就能得出引物序列。甚至你也可输入基因的名称，或蛋白质的名称，或者对应的Locallink都可以查到。目前引物主要针对人和小鼠的，今后将拓展到其它物种，如大鼠等。它的引物成功率达到99%，强烈推荐！这个数据库的引物设计的规则 ...

迷北方的狼 战友整理了5月上旬的0应助帖，我仔细看了一下，有很多都是因为提供的信息不够多，或者，可以在精华区轻松搜索得到答案的帖子。我将5月下旬的帖子整理一下，热心战友请积极应助:P整理过程中发现，不规范帖的0求助绝大多数是不规范帖。不知道本次整理会不会助长不规范帖的增长，希望不是！为了您的问题得到快捷和有效的解答，为了版面的整洁，请按规范发帖！另外，声明几点：1 留qq号而且标题也不规范的帖子没有整理。2 标题简单的写”求助 ...

增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3'端 ...

PCR基础分子生物学技术正以惊人的速度发展，特别是近20年来已经成为生命科学的一个主要的生长点。1976年cDNA克隆技术的建立，使分子生物学更加迅速广泛地渗透到医学各学科，发展了各学科的分子理论基础。1985年Mullis首先描述的多聚酶链反应（ PCR， Polymerase Chain Reaction ），使一向昂贵、繁杂、严格的分子生物学试验能够在比较简易、经济的条件下有效的开展，是基因分析技术的一项重大突破。这一技术 ...

近四个月来，我关于肿瘤系列实验设计方案的演变历程2003年9月25日，我完成了第一个实验设计方案“我的实验设计”，共有5个实验，是用化学致癌物做大鼠肝癌模型，实验的核心就是做支配肝脏自主神经的电生理参数测定，看看自主神经放电强度和正常对照组相比是否出现了显著性降低；如果实验组自主神经放电强度和正常对照组相比出现了显著性降低，那么，再比较自主神经放电强度降低出现时间和大鼠产生肝癌时间的先后，以明确因果关系。此前， ...