PCR技术

Q1．CT值出现过晚1.扩增效率低，反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。2.PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。3.PCR产物太长。一般采用80-150bp的产物长度。Q2．无CT值（信号）出现1.反应循环数不够。一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45cycles），但高于45个循环会增加过多的背景信号。2.检测荧光信号的步骤有误。一般SG ...

1。二次PCR的第一次PCR产物应该稀释多少倍http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/622786_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/623784_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1025255_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/ ...

PCR实验操作程序1. 在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：反应物 加样顺序 体积(μl) 终浓度去离子水 1 29.410×Buffer B 2 5 1×4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/LMgCl2 4 3 1.5mmol/L有义引物 5 2.6 0.25μmol/L反义引物 6 2.6 0.25μmol/L模板 7 2 0.1μgTaqDNA聚合酶 8 0.4 1unit2.用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50μl矿物油。每加一管换一次Tip。3.振荡每只管，然后短暂离心。4.将管放到 ...

我正在做用SYBR GREEN I做荧光染料的实时定量PCR，遇到的问题不少，同时也有点心得，借些平台和各位站友交流，望各位给以指证和帮助。首先，主要的问题是反应效率低下：我用10-1 ～10-9 的浓度梯度的反转录产物作为模板，预设它们的浓度是1×10-1 ～10-9 ，结果作出的各个模板浓度对应的CT值与理论完全相反，即：浓度越小，反应曲线就越快地起峰，就是CT值越小。作溶解曲线有时单峰，有时是双峰。BIO-RAD的ICYCLER软件作 ...

关于新基因的克隆，有几种方法，其中关于PCR的有：1．简并引物PCR法根据编码氨基酸的密码子的摇摆性，将编码一种氨基酸的多个密码子并列设计成一组引物进行PCR扩增，适用于克隆已知氨基酸序列的基因、某基因家族的新成员和不同物种的同源基因。可根据氨基酸序列推测核酸序列，或根据基因家族已知成员的核酸序列，选其保守区或相对保守区设计简并引物，然后用PCR法从一定组织的cDNA文库中扩增目的基因。该法结合3’RACE（r ...

RNA isolation and real-time quantitative RT-PCRTotal RNA was isolated from lung, kidney and spleen issue of Smad3-/- and WT mice with TRIzol reagent (Invitrogen, Gaithersburg, MD). For first-strand cDNA synthesis, 2.5 μg total RNA were dissolved in 25 μl DEPC-treated ddH2O. Five microliters of ...

呵呵，希望各位高手多多参与，及时帮助广大战友解决问题哈！质粒做realtimepcr用的标线的几个问题普通的RT-PCR所用的引物能采用文献中Real Time PCR的引物吗关于位点特异性引物设计无脊椎动物的内参照用什么豚鼠RT-PCR内参是什么请教PCR问题关于内参的问题/G+的链球菌（原核）的内参是什么长PCR分段扩增后的酶切连接问题,PCR带消失了测序结果信号差的原因扩增支原体16srRNA基因如何设置内参 ...

以下为自己参考书籍整理，希望能对新手有一点帮助。我自己也是新手，想和大家共同进步！影响PCR反应的参数PCR反应的基本成分PCR包含7种基本成分1.热稳定DNA聚合酶：常规PCR，最常选用Taq DNA聚合酶（每个标准的25～50μl反应体系用0.5～2.5U）。（实验室Taq DNA聚合酶为5U/μl）2.一对引物： 这是影响PCR反应的最关键因素。标准PCR反应每条引物的典型浓度是0.1～0.5 μmol/L。（实验室所用引物按要求稀 ...

xjktony扩增模板的GC 含量为66％,也不算很高,我做过更高的GC 含量(80%)的PCR.对于这种高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二级结构的影响,当然现在也有专门这种PCR Buffer卖.vanny宝生物有这种做高GC含量的酶和buffer，称为LA TAKARA酶，里面有GC buffer，效果还不错。westernblot你用DMSO5％加到里面，60％应该不是算高的，如果实在不行，就用advantage 2 high ...

PCR-SSCP的发展现状　　随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问 世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称 PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性 片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等等已成 为基因分析的有力工具.但这些方法操 ...

DQ探针是上海辉睿生物自行开发的拥有自主知识产权的第五代探针技术，DQ探针打破了荧光定量PCR领域国外专利技术垄断的现状，并成为国家“十一五”“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项成果中的亮点，解决了大量细菌耐药、SNPs等方面中单碱基突变特异性检测的难题。研发背景：思考→什么是核心竞争力？测序、荧光定量 → ABI → 美国 诊断试剂 → Roche → 瑞士化学试剂 → Sigma → 美国 液相芯片 → Luminex→ 美国LNA(锁核酸) → Exiqon → 丹麦 中国 ？？？？？？？？ ...

有战友做PCR-SSCP吗？下面是找到的有关PCR-SSCP的原理及具体的protocol，同大家一齐分享，希望对各位有所帮助！聚合酶链反应一单链构象多态性分析 (PCR-SSCP)　 聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP）是近年来发展起来的一种基因分析方法。　PCR-SSCP ...

来自该网站：http://www.archimedes.rwth-aachen.de/MolbioProtocols/Phage%20Display/PCR%20amplification%20of%20variable%20regions%20(SOE-Protocol).htmlThe SOE-Protocol given below utilises our initial set of primers for mouse and chiocken phage displ ...

平端连接　　通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19的Hinc ...

PCR 引物设计及软件使用技巧摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。关键词：PCR；引物设计中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编号：1自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子 ...

我要作半定量RT-PCR,在文献上查引物序列用Primer分析，才50-60分，不知是直接引用文献的好，还是自己设计.下面是我从文献上查的几对引物，请帮忙看一下，可否直接引用，还是要重新设计。本人就要开始作RT-PCR了，急需您的帮助。Smad3 (308 bp, GenBank Accession No. NM_005902)5’-CAGAACGTCAACACCAAGT (nt 238–256)and 5’-ATGGAATGGCTGTAGTCGT (nt 545 ...

【求助】有谁做过透析袋电洗脱DNAhttp://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5875697&sty=1&tpg=32&age=0【求助】用superscript III做5' RACE的方案，请指点http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=5876087&sty=1&tpg=32&age=0【求助】请问PRIMER PREMIER 有几版啊?http://www.dxy.cn/b ...

各位大侠：我是PCR新手，第一次作PCR，模板是含ANX A5的原核质粒。ANX A5的DNA全长如下ccatggcaca ggttctcaga ggcactgtga ctgacttccc tggatttgatgagcgggctg atgcagaaac tcttcggaag gctatgaaag gcttgggcac agatgaggagagcatcctga ctctgttgac atcccgaagt aatgctcagc gccaggaaat ctctgcagc ...

提问：降落PCR（Touchdown PCR）的原理？回答：Touchdown PCR是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度，直至达到“Touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异（每摄氏度造成4倍差异）。因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集该方法的另一 ...

该贴转自生物试验网2007年9月14日发表的文章实时定量PCR以其精确、快速、方便，越来越多的应用在科研、临床及检验检疫的各个领域。但是定量PCR是对精确性要求很高的实验，实验的条件对实验结果的影响非常大。在此谈谈体系优化的问题，希望对做相关试验研究的战友有所帮助1.基本参数的优化：1）MgCl2的浓度：在PCR反应中，MgCl2的浓度对酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低 ...