RNA实验技术

初级microRNA（pri-miRNA）是长链非编码RNA转录本，至少有一个（更常见的是多个）约65 nt茎环结构的前体microRNA（pre-miRNA），这些前体microRNA中含有成熟的microRNA（miRNA）序列。TaqMan Pri-miRNA Assays让这种新“基因”种类的转录能够轻松方便地定量，其灵敏度和特异性足够分辨多个miRNA位点。

肽核酸(PNA, peptide nucleic acid)是一种全新的DNA类似物，于1991年由Dr.Nielsen, Dr.Egholm,Dr.Berg,和Dr.Buchardt发明。该分子的特点是以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同。PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。

在发育或分化的不同阶段以及疾病模型中，利用miRNA特异的芯片能绘制出细胞和组织的miRNA表达谱，这能够揭示出参与了这些进程的特定miRNA。miRNA的过表达和沉默，则是一种有力的方法来研究miRNA的功能。这些研究应当在细胞内或体内进行，并与表型和基因表达分析相结合

如何提取高质量RNA?

科研中的“新星”技术——MicroRNA荧光定量PCR

众多文献报道，许多植物由于未能有效地分离纯化出其组织中的RNA， 而阻碍了其分子生物学方面的研究进展。比如Northern杂交分析，体外翻译分析或建cDNA文库，RT-PCR及差异显示分析等研究，都需要高质量的RNA。因此，提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在。

众所周知，从土壤中提取DNA已非易事，而想从中再提取RNA可说是难上加难。DNA不容易提取是因为本身土壤中富集的材料就少，提取过程相对复杂，造成操作损失；而RNA不容易提取除了以上所提到的原因外，还有一个很关键的原因——无处不在的RNA酶，对RNA的稳定存在构成极大威胁。另外还有一点就是土壤中某些物质的微量残留都会影响到科研人员后期PCR反应。这就是目前国际国内市场中土壤RNA提取产品不多的原因。

在用血液标本进行表达谱芯片实验时，需要把血液中有核细胞的RNA提取出来；传统的提取RNA方法是把先把有核细胞从全血中分离出来，需要加白细胞分离液、离心等步骤，比较繁琐。目前有一些公司生产了相关试剂，可以从全血中直接提取RNA。我们比较了不同公司的产品后，认为北京百泰克生物公司生产的TRI pure LS Reagent用于全血有核细胞的RNA抽提效果较好，可以满足基因表达谱芯片的分析要求。一般1ml的全血可以得到10μg左右的total RNA，足够满足芯片分析的需要。

miRNA在细胞的发育、分化、增殖、凋亡，每个过程都有miRNA的调控，在许多人类肿瘤病例中，都发现miRNA表达异常，于是，miRNA表达谱分析成为miRNA研究中必不可少的一环。

随着研究的深入，已知miRNA的数量与日俱增，目前Sanger miRBase数据库中收录的人miRNA已达721条。在基因功能研究中，最有效的方法是阻止特定基因的功能，然后了解其后果。miRNA同样如此。

这一方法原于McMaster和Carmichael（1977）。 含有乙二醛-DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳， 因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H+梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛-DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。 1）在灭菌的微理离心管内，混 ...

当RNA自琼糖凝胶转移至NC膜之前，EB的染色时间不宜过长，被染料饱和的核酸分子转移效率会降低。用EB作短暂染色，可以对核酸转移过程产生可以察觉的掏作用，并同时检测凝胶和凝膜上的RNA的优点。 １）电泳结束后，含乙二醛－DMSO的凝胶应浸入含溴化乙锭（0.5μg/ml）的10mmo ...

2009年9月15日，Sanger microRNA序列数据库（miRBase）（http://www.mirbase.org/）升级至14.0版。新增1580条miR序列。至此，miRBase中的microRNA序列信息已超过10,000条。14.0版本共收录10,581条成熟miRNA序列信息，通过验证的microRNA发夹前体从9,539条增至10,883条，共涵盖115个物种。

miRNA这个不起眼的小分子原来是基因表达的重要调节器。它们还与多种癌症相关，也就理所当然成为药物靶点。另外一种在细菌中鉴定出的piRNA也是反式作用的小干扰RNA，虽然现在研究得较少，但也是前途无量。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。

RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。

众所周知，从土壤中提取DNA已非易事，而想从中再提取RNA可说是难上加难。DNA不容易提取是因为本身土壤中富集的材料就少，提取过程相对复杂，造成操作损失；而RNA不容易提取除了以上所提到的原因外，还有一个很关键的原因——无处不在的RNA酶，对RNA的稳定存在构成极大威胁。另外还有一点就是土壤中某些物质的微量残留都会影响到科研人员后期PCR反应。这就是目前国际国内市场中土壤RNA提取产品不多的原因。

在样品用液氮瞬间冻结之后，应该储存在-80°C，千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻，也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉，然后置于裂解液中进行匀浆。

本文总结了一些RNA抽提过程中的技巧和注意事项，可以作为新手入门指南。

有许多植物就是由于未能有效地分离纯化其组织中的RNA， 而阻碍了其分子生物学方面研究的进展。这些植物组织中，或富含酚类化合物，或富含多糖，或含有某些尚无法确定的次级代谢产物，或RNase的活性较高。在完整的细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的，但当组织被研磨，细胞破碎后，这些物质就会与RNA相互作用。酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丢失，或 ...