RNA实验技术

1．分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1~10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。2．苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。3．分别用TE（pH 8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100 ng/ml。 假设1 bp相当于660 Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。4．将载体DNA去磷酸化。5．按下表将适量的DNA转移至无 ...

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或 者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因，相信 ...

TRTn3 terminal inverted repeatslacZ5'-truncated lacZ gene encoding beta-galactosidaseLEU2LEU2 gene from S. cerevisiaeampEncodes beta-lactamaseloxPlox site target for Cre recombinaseUses: Gene disrupti ...

1. Add an equal volume (equal to sample volume) of P/C to sample.2. Mix (shake don't vortex).3. Take aqueous (upper) layer. (If dirty sample repeat Ph/Chl step until interface is fairly clean).4. Add ...

1、取对数生长期细胞一个T75或T25瓶。2、将培养基换成10ml DMEM(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培养基，处理1~2小时。3、将细胞培养液倒掉，马上加入3~4ml 0.1%胰蛋白酶，并立即摇晃0.5~1min。当在显微镜下看到分裂相细胞脱壁后，马上加入终止液终止消化，并将分裂相细胞收集在一个15ml的离心管中，并在1200r/min离心4min。4、将上清液倒掉，剩余50 ...

　　外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子布有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠 ...

质粒除有抗性基因外，往往还带有其他明显的筛选标记，最常用的是蓝白斑筛选（ -半乳糖苷酶系统）。此类载体携带lacZ’基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），并且处于可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下。质粒转化的宿主菌为LacZ△M15 基因型（含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。未重组的质粒转化宿主菌后 ...

定位克隆（positoinal cloning），又称图位克隆（map-based clonig），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基 ...

・CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤 1．前夜接种受体菌（ DH5α或 DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）； 2．取 1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）； 3．将 0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷； 以下步骤需在超净工作台和冰上操作 4．吸取 1.5ml培养好的菌液至1.5ml ...

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHIHindIII提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。 ...

分子杂交的概念及基本原理一、分子杂交的概念： 分子杂交（molecular hybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。 利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 二、分子杂交基本原理： （一）DNA变性 ： DNA变性是指 ...

EB是我们从事生命科学尤其是分子生物学经常要接触的致癌性物质且不好处理.现提供如下方法供参考.特别是刚走进实验室未生育的新同行一定得学会保护自己呵否则还涉及到下一代问题 实验室中经常有EB被打翻或EB废弃物的处理问题，如何做到标准处理？1严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害很大。2废EB溶液的处理方法(1)对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： a.将EB ...

细胞内的核酸多以核蛋白的形式存在，其中脱氧核糖核蛋白主要存在于细胞核中，核糖核蛋白主要存在于细胞质中。这两类核蛋白在0.14mol／L氯化钠溶液中的溶解度相差很大，核糖核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度，脱氧核糖核蛋白的溶解度却相当低。制成肝匀浆后，用0.14mol／L氯化钠溶液抽提，可将两种核蛋白分离。分离过程中加入少量柠檬酸钠，可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的水解作用。SDS(十二烷基硫酸 ...

DNA以核蛋白形式存在于细胞核中，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K及链霉蛋白酶E的应用使这两个原则得到了保证。 蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为广谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细咆膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA分子分离，EDTA抑制细胞中DNase活 ...

ESTs（Expressed Sequence tags）是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5’末端或3’末端对插入的cDNA进行一轮单向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。ESTs的产生：从特定的状态的组织或细胞中分离mRNA，将mRNA逆转录成cDNA亚克隆到载体中，利用载体上的引物对插入片段测序测序出来的片段结果即称为ESTs(expressed sequenc ...

LEVEL I Figure 7.3 Isolated microsomes Figure 7.4 TEM of hepatocyte MATERIALS 1% Glutaraldehye (GTA) 1% Osmium tetroxide Epoxy or vinyl resin for TEM TEM photomicrograph of liver cells ...

摘要 RNAi技术是研究基因功能的重要工具。其原理是对某个已知基因，设计诱导其沉默的dsRNA，通过合适手段导入细胞或机体使产生干涉效应的信号分子siRNA，导致基因表达水平下降或完全沉默。通过基因表型变化，鉴定该基因功能。从RNAi的研究背景和作用机制出发，对近年来利用RNAi技术研究植物基因功能的概况、诱导方法和载体作一综述。 　　关键词 基因沉默；RNAi技术；植物基因功能 　　 　　1RA ...

监测手段：对脱靶效应的监测一般通过基因芯片来监测。Gene expression profiling对脱靶效应。脱靶效应的特性：转录物表达模式有序列特异性和靶特异性两种大部分脱靶效应具有siRNA序列特异性低浓度也可能产生脱靶效应，不仅仅是高浓度能产生脱靶效应的假象。脱靶效应在蛋白和mRNA水平同时考虑进行分析，要缜密分析和确定分析的时间点。特别是要确定脱靶效应是否是蛋白被knock－down的次 ...

Mike W. Byrom Angie M. Cheng and Lance P. Forundefined Ambion Inc. 2130 Woodward Street Austin TX 78744-1832 *Corresponding author email: lford@ambion.com AbstractSmall interfering RNA (siRNA) is an extremel ...

在活体RNAi关键点：类似药物属性的引入，如稳定性、细胞内的传送、组织的生物可溶性进入合成的siRNA.授予siRNA类似药物的属性化学稳定性的胆固醇共聚的siRNA 显著的改善了其在体内和体外的药物属性。化学稳定性增强的方法：对正义和反义链进行部分的phosporothioate backbone和 2’－O－methyl sugar 修饰，增加其在血清中和组织匀浆中对核酸内切酶和外切酶的抗性。 ...