DNA实验技术

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非 ...

二苯胺法测定DNA含量【实验目的】 掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法 【实验原理】 DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊酸，后者与二苯胺试剂反应产生蓝色化合物，其反应如下图。蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40µg ~400µg范围内时，吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应 ...

一步法提取质粒DNA主要用于鉴定阳性克隆。主要步骤如下：收集1.5mL菌体，彻底除去培养基；加入50ulSTE缓冲液重悬菌体；加入50ul酚：氯仿;异戊醇（25：24：1），混匀；12000rpm离心5分钟，取上清到另一离心管中；加入NH4Ac至终浓度2M，并加入2倍体积的乙醇，混匀，室温或冰上放置几分钟；12000rpm离心5分钟，弃上清，75%乙醇清沉淀；沉淀干后，以水或TE缓冲液溶解，便可进 ...

一步法提取质粒DNA主要用于鉴定阳性克隆。主要步骤如下：收集1.5mL菌体，彻底除去培养基；加入50ulSTE缓冲液重悬菌体；加入50ul酚：氯仿;异戊醇（25：24：1），混匀；12000rpm离心5分钟，取上清到另一离心管中；加入NH4Ac至终浓度2M，并加入2倍体积的乙醇，混匀，室温或冰上放置几分钟；12000rpm离心5分钟，弃上清，75%乙醇清沉淀；沉淀干后，以水或TE缓冲液溶解，便可进 ...

基因工程又称遗传工程、DNA 重组技术、分子克隆等。它是七十年代在分子生物学发展的基础上形成的新学科。所谓基因工程，就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）某一生物的遗传物质，在体外切割，拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA 分子引入受体细胞，使外源DNA 在受体细胞中进行复制和表达。按人们的意愿定向创造生物新性状，使之稳定地遗传给下一代。所以基因工程具有广阔的应用前景，即能为工农业生产和 ...

单链构象多态性（signle strand conformation polymorphismSSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中 ...

基因工程又称遗传工程、DNA 重组技术、分子克隆等。它是七十年代在分子生物学发展的基础上形成的新学科。所谓基因工程，就是在分子水平上，用人工方法提取（或合成）某一生物的遗传物质，在体外切割，拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA 分子引入受体细胞，使外源DNA 在受体细胞中进行复制和表达。按人们的意愿定向创造生物新性状，使之稳定地遗传给下一代。所以基因工程具有广阔的应用前景，即能为工农业生产和 ...

体外连接的重组DNA分子导入合适的受体细胞才能进行大量复制，增殖和表达，其首要目的是获得大量的克隆基因。虽然PCR技术，体外转录及翻译系统能部分达到大量扩增的目的，但毕竟受到体外操作的许多限制。重组质粒导入宿主细胞最常用的方法之一就是转化（transformation）。转化这一概念来源于遗传学：细菌细胞的生物学由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化。很多细菌如杆菌，链霉菌属能自然发生转化，其它 ...

一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致MSP扩增失败，体会如下：(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3．0～3．9 mol/L为好，其pH值必须用NaOH精确调整至5．0；(2 ...

TROUBLESHOOTINGNo products are visible in any lane.1. Potential Problem: PCR amplification is not initiated.Recommendations:a. Confirm that all PCR components were added to the reaction tube.b. If per ...

TROUBLESHOOTINGNo products are visible in any lane.1. Potential Problem: PCR amplification is not initiated.Recommendations:a. Confirm that all PCR components were added to the reaction tube.b. If per ...

一、 材料　　不同来源的DNA(50ng/ul)。 　　二、设备 　　PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置。 　　三、试剂 　　1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。 　　2、Taq酶：购买成品。 　　3、10xPCR 缓冲液：配方见第八章。　　4、MgCl2 ：25mmol/L。 　　5、dNTP：每种2.5mmol/L。 　　四、操作步骤： ...

　　（1）石蜡切片脱蜡入水后，置0.1mol/l PBS pH7.2冲洗5min；冰冻切片直接入PBS冲洗5min。　　（2）0.1mol/l 甘氨酸PBS冲洗5min。　　（3）0.4%Trition X-100 PBS 冲洗15min。　　（4）蛋白酶K1μg/ml（0.1mol/l Tris �HCl pH8.0 50mmol/L EDTA配）37℃保温30min。　　（5）4%多聚甲醛PB ...

　　（1）石蜡切片脱蜡入水后，置0.1mol/l PBS pH7.2冲洗5min；冰冻切片直接入PBS冲洗5min。　　（2）0.1mol/l 甘氨酸PBS冲洗5min。　　（3）0.4%Trition X-100 PBS 冲洗15min。　　（4）蛋白酶K1μg/ml（0.1mol/l Tris �HCl pH8.0 50mmol/L EDTA配）37℃保温30min。　　（5）4%多聚甲醛PB ...

　一、 DNA酶切反应 　　1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl再加入重蒸水使总体积为19μl将管内溶液混匀后加入1μl酶液用手指轻弹管壁使溶液混匀也可用微量离心机甩一下使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低 ...

当双链DNA分子的一条链上产生切口时E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸从而使切口沿着DNA链移动用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: ...

当双链DNA分子的一条链上产生切口时E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸从而使切口沿着DNA链移动用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响: ...

RFLP操作要点 　 　　一、 材料 　　基因组DNA(大于50kb分别来自不同的材料)。 　　二、设备 　　电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸 ，eppendorf管(0.5ml)若干。 　　三、试剂： 　　1、限制性内切酶(BamHⅠ EcoRⅠ HindⅢ XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。 　　2、5×TBE电泳缓冲液 ...

RFLP操作要点 　 　　一、 材料 　　基因组DNA(大于50kb分别来自不同的材料)。 　　二、设备 　　电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸 ，eppendorf管(0.5ml)若干。 　　三、试剂： 　　1、限制性内切酶(BamHⅠ EcoRⅠ HindⅢ XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。 　　2、5×TBE电泳缓冲液 ...

TA克隆常见问题分析及其解决方案 问 题 可能的原因 建 议 转化后无 克隆菌产生 转化过程有问题或感受态细胞失活 可通过转化pUC18/19等未切割的可用于抗性筛选的质粒，检测感受态细胞的转化效率和转化操作是否正确 插入对照DNA片段的阳性率低 10×快速连接缓冲 液稀释不当 提供的T4 连接酶缓冲液为十倍浓度，10μl 反应体积加1μl T4 连接酶缓冲液 连接反应存在问题 连接缓冲液只有低的 ...