DNA实验技术

General GuidelinessiRNA targeted sequence is usually 21 nt in length.Avoid regions within 50-100 bp of the start codon and the termination codonAvoid intron regionsAvoid stretches of 4 or more bases s ...

基因构建策略下面我们介绍一下转基因和基因打靶载体构建策略的一般原则。 ...

1) Transfect cells.2) Culture cells 1-3 passages in a T-75 flask containing selection material (e.g. hygromycin neomycin etc)3) Pellet cells and resuspend at a concentration of 1 x 105 cells/ml in sel ...

蛋白印迹(Western Blot)常用试剂蛋白抽提货号品名规格价格备注WB003组织蛋白抽提试剂100ml300全蛋白抽提WB004RIPA裂解液100ml100全蛋白抽提WB005细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂100次680　WB006膜蛋白和胞质蛋白抽提试剂100次680　WB007改良Western及IP细胞裂解液100ml320　WB008蛋白酶抑制剂混合物(20X)1ml200　WB0 ...

一、实验目的 观察分析植物细胞有丝分裂中期染色体的长短、臂比和随体等形态特征，学习染色体组型分析的方法。了解和掌握不同物种染色体组型和带型分析的方法和技术，进一步鉴别染色体结构和染色体组。要求至少利用一种方法制备出一个物种的合格的染色体标本，进行组型分析或进行不同的带型，如G-带、C-带等分析。练习显微摄影的操作过程，拍摄和印放显微照片。二、实验条件本实验在遗传学实验室完成。遗传学实验室提供： 1 ...

一、实验目的1、学习克隆工作中最常用的双酶切；2、学习将外源基因与质粒连接方法及操作技术；3、学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的技术；4、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。5、外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。6、学习鉴定重组子的方法。二、 实验原理重组子的建立：采用双酶切质粒载体pBR322和pUC18，酶切后产生了互补的粘性末端，在T4 DNA 连接酶的作 ...

Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统��体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物��分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时 ...

与rRNA和tRNA不同的是，哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3'端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNAdmonds等，1971;At Leder，1972）。在构建cDNA文库时， 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时，与总RNA相比，采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的 ...

随着DNA合成技术的发展，特别是自动化合成技术的引入，人们能简便、快速、高效地合成其感兴趣的DNA片段。目前，DNA合成技术已成为分子生物学研究必不可少的手段，并且已在基因工程、临床诊断和治疗、法医学等各个领域中日益发挥重要的作用。 1. DNA合成在基因工程和分子生物学研究中的应用1.1合成基因　　目前有许多基因和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列已得到阐明，人们已经可以根据需要合成出具有实际应用和研 ...

连接反应的策略 　　可以采用几种策略来进行外源ＤＮＡ片段和质粒载体的连接。对此，可依据外源ＤＮＡ片段未的性质，以及质粒载体与外源ＤＮＡ上限制酸切位点的性质来作出选择。（一）外源ＤＮＡ片段未的性质带有各种未的外源ＤＮＡ的克隆方法见下表：────────────────────────────────────────────外源ＤＮＡ片段所带未端 　　克隆的要求 　说明─────────────── ...

在某些情况（例如用寡核苷酸作Southern印迹杂交的探针）下，重要的是要将寡核苷酸标记至尽可能高的放射性比活度。磷酸化反应最多能使每一寡核苷酸分子中掺入一个32P原子。但用大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段3合成与合成寡核苷酸互补的DNA链， 则可得到比活度更高探针（Studencki 和Wallace，1984;Ullrich等，1984b）。用一短引物与寡核苷酸模板结合，后者的序列互补于 ...

一、核酸的纯化　　在分子克隆的所有操作中，最基本的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋白质，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时，可进行这种抽提。然而，如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸，则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后，再用有机溶剂抽提。这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K等，它们对多种天然蛋白均有活性，（1）用 ...

　电泳完毕后，可立即将乙醛酰RNA自琼脂糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法：毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细管洗脱法如下所述， 真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必（Thomas，1980）甚至有害（Thomas，1983），但我们认为含甲醛的凝胶必须用经DEPC处理的水淋洗数次，除去甲醛。 如果琼脂糖中浓度大 ...

合成的寡核苷酸在合成时其5'端缺少一个磷酸基， 因而极易用T4噬菌体多核苷酸化反应，这种探针可达到于γ＝32P从γ＝32PATP本身同样高的放射比活度。下面所述的反应是为对10pmol寡核苷酸进行高比活度的标记而设计的。通过扩大或缩小这一反应的规模便可成功地标记不同量的寡核苷酸，而各成分的浓度则可保持不变。 1）配制下列反应混合液：寡核苷酸（10pmol/μl） 1.0μl10xT4噬菌体多 ...

这一方法原于McMaster和Carmichael(1977)。 含有乙二醛－DMSO的凝胶比含有甲醛的凝胶更难于进行电泳， 因为前者泳动速率较慢而且需将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的H＋梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨率（Miller，1987），但用含朋乙二醛－DMSO的凝胶对RNA进行分级离，通常Northern杂交所显示的RNA条带更为锐利。1）在灭菌的微理离心管内，混匀 ...

　如今，质粒载体中限制酶切位点的种类极为繁多，因而通常都有可能找到某种带限制酶切位点恰恰与外源ＤＮＡ片段本身毫无二致的载体。这就具备一个不可比拟的优点，也应是可以用相应的限制酶消化重组质粒崦回收外源ＤＮＡ。另一种方案，则是把片段插入到载体中能产生匹配末端的任何位点中。例如，识别不同的六核苷酸的限制酶BamHl和BglⅡ产生具有相同突出末端的限制酶切片段，这样用BglⅡ消化而制备的外源ＤＮＡ片段可以 ...

当ＲＮＡ自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之前，溴化乙锭的染色时间一般不宜过长，这是因为被染料饱和的核酸分子，其转移效率有所降低。然而，用溴化乙锭作短暂染色，既不至于对核酸转移过程产生可以察觉的掏作用，又独具同时检测凝胶和凝膜上的ＲＮＡ的优点。１．方法Ｉ １）电泳结束后，含乙二醛－ＤＭＳＯ的凝胶应浸入含溴化乙锭（0.5 μg/ml）的10mmol/L磷酸钠（pH7.0）溶液。甲醛凝胶需用无Ｒ ...

没有的位点：NotI SfiISpelAatI6个位点:123473148133000399954059940617片段长度:190441243678866995151960418AatII10个位点:511093991124814979290414081141118422524556845597片段长度:14062117705109428937313316290618491134 30729Ac ...

慢病毒载体构建.pdf

1. 引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种 主要都是由ABI/PE 公司生产，而Bioneer自行研制的专利384并行高通量DNA合成仪，可实现99%的高合成率。无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定 ...