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做过 qPCR 实验的小伙伴都知道，稳定和精确的 qPCR 实验常和 PCR 的扩增效率有关。实验中，为了确保 qPCR 实验结果的准确，建议在实验前通过标准曲线的实验评估 PCR 的扩增效率。做标准曲线实验的时候，建议将标准品进行至少 5 个数量级的梯度稀释，每个梯度稀释液进行 3 次重复，然后将稀释的标准品进行 qPCR 实验，最后根据各样品的浓度（或未知浓度样品的稀释倍数）及相应的 Ct 值绘制标准曲线（图 1）。图 1. 扩增曲线和标准曲线其中，slope 是标准曲线的斜率，Eff% 是扩增效率，Eff%= 10(-1/slope)-1，一般建议扩增效率在 90%-110% 之间。R2 是用来衡量拟合曲线和单个数据点之间相关性的参数，一般建议在 0.99 以上。然而，看似简单的实验，做起来却会遇到各种各样的情况，经常有客户咨询标准曲线实验相关的问题。今天，小编就通过几个案例来给大家介绍一下标准曲线结果异常的几个常见原因，内容涉及实验操作和软件设置，希望能对大家的实验有所帮助。 案例 1：标准曲线的趋势不对在这个案例中，低浓度的标准品稀释液对应的 Ct 值比较小，而高浓度的标准品

在上一篇文章《没有 CT 值，我的 QPCR 实验失败了吗？（上）》中，小编给大家讲述了 CT 值是什么，它是如何产生的，并分析了一些没有扩增曲线导致无法计算 CT 值的案例。但除此之外，有的时候也会出现有扩增曲线，但没有 CT 值的情况。我们今天的这篇文章就继续分析有扩增曲线，但没有 CT 值的一些案例。 情况三：有扩增曲线有扩增曲线的情况也可以分为两类：有正常的扩增曲线和异常的扩增曲线。案例 5：有时候我们会发现明明扩增曲线是正常的，但却没有 CT 值。比如在图 7A 这个案例中，我们在多组分图里能看到部分孔是有正常扩增的，但是 CT 值一栏却都显示 Undetermined。当我们在扩增曲线图下方的 Options 中勾选上「Show: √Threshold」的时候，会发现自动阈值线设得特别低，跟扩增曲线没有交点（图 7B）。回顾我们前面说过的，CT 值是根据扩增曲线与阈值线的交点来计算的，那么当阈值线与扩增曲线没有交点的时候，没有 CT 值也就毫不意外了。图 7 阈值线设置太低导致没有 CT 值再说回这个案例，为什么自动阈值线会画得那么低呢？其实是因为很多没有加试剂和模板的孔（

「为什么我的实验没有 CT 值？」「是我的实验/试剂/引物/仪器/操作有问题吗？」「我的实验必须要重做吗？」作为技术支持的小编，经常碰到客户问类似的问题。小编也理解，对于做荧光定量实验的老师们而言，CT 值是一个非常重要的数据，有时候大家忙活半天就是为了得到一个 CT 值。而实验做完却没有 CT 值，的确是很让人郁闷的情况。但是导致没有 CT 值的原因不仅仅是实验失败，今天，小编就给大家总结一些常见的导致荧光定量结果没有 CT 值的原因，希望能对大家有所帮助。在解释为什么会没有 CT 值之前，让我们先看一看 CT 值是什么，它又是怎么产生的。■ CT 值的全称是 threshold cycle，指的是扩增曲线的荧光值达到阈值线时的循环数，它能反映起始模板的浓度，所以是荧光定量实验的重要数据。那么 CT 值是怎么产生的呢？荧光定量软件会对扩增反应的荧光曲线进行分析，画出基线（baseline）和阈值线（threshold）。基线通常是从循环最初信号稳定以后画到扩增曲线起峰前，代表了反应孔的背景荧光信号，图 1 中 A 图就标出了扩增曲线的基线位置。画基线的目的是为了扣除基线，如果把扩增

近几年，从科学研究到临床检测，从「非洲猪瘟」检测到「新冠病毒」检测，荧光定量 PCR 仪器已成为分子生物学研究的常规设备。检测方法的迅速发展，检测任务的紧急也对检测人员提出了更高的要求，需要他们具备熟练判断数据结果的能力。对于荧光定量 PCR 的结果的判断，最直观的判断就是看扩增曲线是否正常。很多老师在平时实验中会遇到异常扩增曲线的困扰，比如打折的扩增曲线、复孔间重复性不好、阴性样本扩增曲线抬升等。面对异常的扩增曲线，大家也不用担心，接下来我们会结合几个实例，带着大家一起来看一下比较常见的异常扩增曲线的分析攻略。 1、确认软件设置是否正确对照试剂盒说明书，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。有一个比较容易忽略的设置问题是，需要看下所选用的试剂中是否含有 ROX 来作为参比荧光染料。Applied Biosystems™ 系列荧光定量 PCR 仪器可以用 ROX 来作为参比荧光染料，用以校正仪器系统以外的物理误差，比如均一化校正由于移液误差或者蒸发导致的批内体积误差等。目前市面上有的的荧光定量 PCR 预混液是不含有 ROX 的，当用此类试剂的时候，应该将 ROX 参比功能关

实时荧光定量 PCR 技术（Quantitative Real-time PCR，简称 qPCR）是在 PCR 扩增过程中，通过实时监测荧光信号的变化，达到对待检测样本中初始模板定量分析的方法。当前 qPCR 技术被广泛应用于临床疾病诊断，动物疾病监测，食品安全分析等领域。随着 2020 年新冠疫情在全球的蔓延，qPCR 技术更是因其检测通量高，速度快，操作简便等优势成为新冠病毒核酸检测的有效方法被众人所熟知。那么为了得到可靠、准确的检测结果，我们需要注意哪些方面呢？其实决定一次实验成功的因素有很多，从样本的质量，引物探针的设计，再到 PCR 反应体系中各组分的比例优化等。当我们准备好了这些，在上机检测时又要根据实验目的正确完成程序设置，才能最终得到良好的实验结果。那么今天我们就从荧光定量 PCR 软件程序设置入手来介绍一下这其中需要注意的一些方面。 Part 1：规范正确的新建实验方式当我们准备好样品开始进行上机测试时，第一步就是新建实验。此时我们可以通过点击 Advanced Setup（图 1A，图中红框）或 Create New Experiment（图 1B，图中红框）的方式

10x Visium空间转录组测序针对FFPE样本的实验已经开展有一段时间了，今天小编就来总结一下整个实验的详细流程。首先来一张实验流程导图：10xVisium FFPE的实验流程FFPE样本Visium空间转录组技术流程（图片引自10x官方）一、取材FFPE样本取材要求组织不要大于6.5mundefined6.5mm，因为10x visum的每张切片的捕获区域只能容纳6.undefined6.5的组织大小，≤6.5 x 6.5 mm的组织块可与Visium Spat ...

1、变性温度和时间：模板 DNA 和 PCR 产物的变性不充分是 PCR 失败的主要原因。适宜的变性条件是 95℃ 30s 或 97℃15s。变性不完全，DNA 双链会很快复性，因而减少产量。在变性中，温度太高或反应时间过长，会导致酶活性的损失。Taq DNA 聚合酶活性的半寿期：92.5℃为 2h 以上，95℃为 40min，97℃为 5min。2、复性温度和时间：复性温度决定 PCR 的特异性，而引物退火温度和所需时间长短取决于反应体系中的基本组成及扩增引物的长度和浓度，实际使用的退火温度要比扩增引物的 Tm 值低 5℃。增加退火温度会增加引物的识别，同时可降低引物 3 端核苷酸的错误延伸。因此，提高退火温度，特别是在前几个循环中，会增加扩增的特异性。而且为了在循环开始获得最高的特异性，应在第一次变性之后，引物退火之前加入 Taq DNA 聚合酶。复性时间一般为 30～60s。3、延伸温度和时间：引物延伸温度一般为 72℃，延伸的时间决定于扩增模板的长度，小于 1kb 的片段一般 1～2min，而 10kb 的片段可能需要 15min 或更长时间。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物

制片前处理类别服务项目备注说明制片前处理石蜡包埋包埋1块固定后组织按客户要求取材，脱水，包埋成蜡块（进口石蜡）特殊包埋（细胞、材料、眼球等）包埋1块包埋要求难度较高(含特殊位置取材)石蜡组织芯片阵列点位包埋客户提供供体蜡块及标本信息软化（肝硬化、皮肤结痂、植物等）1块标本软化较为坚硬组织软化处理骨组织脱钙（小）1块标本脱钙最大面≤2cm²骨组织脱钙骨组织脱钙（大）1块标本脱钙最大面＞2cm²骨组织脱钙骨组织EDTA脱钙 ...

P＝0.05 （双侧）rr（较大均方的自由度）n 2234567891012152030600017993648999229379489579639699779859931001101010181239.039.239.239.339.339.339.439.439.439.439.439.439.539.539.52310.015.415.114.914.714.614.514.514.414.314.214.214.114.013.93410.69.989.609.369.209.078.988.908.848.758.668.568.468.368.26458.437.767.397.166.986.856.766.686.626.526.436.336.236.126.01567.266.605.235.995.825.695.605.525.465.375.275.175.064.964.85676.545.895.525.285.124.994.904.824.764.674.574.474.364.254.14786.065.425.054.824.654.534.434

近年来lncRNA的研究进展迅猛，各类 lncRNA 被大量发现，lncRNA的研究将是 RNA 基因组研究领域非常热门的一个方向。小编也正好也在做lncRNA相关的课题，今天就总结一下lncRNA的研究套路和最新研究进展。• LncRNA基本介绍LncRNA：long non-coding RNAs是一类长度大于200nt，但不编码蛋白质的RNAs，广泛存在于动植物中。它们曾长期被误认为是遗传暗物质，但近些年研究证实这类RNAs在生物的生命活动过程中起着重要的调控作用。 特点1. 长度在200-100,000nt2. 没有编码蛋白质潜能3. 具有细胞或组织类型特异性4. 表达量和保守性比mRNA低5. 部分lncRNA不含有polyA尾巴6. 部分也会翻译小肽段 • LncRNA功能及作用形式 功能1. 结合转录因子，干扰其靶基因，从而调控转录2. 作为分子海绵，吸附miRNA3. 与调节蛋白结合，影响蛋白多聚物的形成4. 招募染色质修饰因子，改变染色质的修饰水平5. 与mRNA配对结合，

一、miRNA的靶基因寻找研究表明，一个基因可以受多个miRNA调控，而一种miRNA又可以参与调控多个靶基因，据预测，至少有30%的人类基因是miRNA的靶基因。这就足以显示出miRNA群体的重要性。而在人类疾病中多不同程度的表现出大量miRNA的上调和下调，这也足以显示miRNA在疾病发生过程中占据着非常重要的作用。而探讨miRNA的功能作用中最重要的一步就是高效准确的寻找到其所调控的靶基因。目前寻找靶基因主要是从以下两个方面入手。1．生物信息学方法miRNA靶基因的预测主要是根据生物信息学的方式进行，主要是根据以下几个方面进行预测：①miRNA与靶基因结合位点的互补性；②miRNA靶位点在不同物种之间的保守性；③miRNA-mRNA结合的热稳定性；④miRNA靶位点处不应有复杂二级结构；⑤miRNA5′端与靶基因的结合能力强于3′端。除以上几个基本原则外，不同的预测方法还会根据各自总结的规律对算法进行不同的限制与优化。目前比较常用的靶基因预测软件有：miRanda、TargetScan、PicTar、miRWalk、miRanda、miRDB等，其中在miRWalk中可以查找到已

化学发光免疫分析技术（chemiluminescence immunoasssay, CLIA）化学发光免疫分析技术是目前世界公认的先进的免疫诊断技术，具有灵敏度高、特异性强、检测线性范围宽等优势，现已广泛应用于肿瘤标志物、传染病、内分泌功能和激素等方面的诊断。磁珠法化学发光免疫技术是将磁性分离技术、化学发光技术和免疫分析技术三者相结合的分析方法。磁珠在化学发光免疫分析技术中起到载体的作用，可以偶联抗体、抗原或者链霉亲 ...

如果一个家系被评估适合进行遗传性肿瘤基因检测，接下来的问题是要决定哪些家庭成员是进行检测的最佳人选？✦ 一般来说，最理想的情况下，最合适/最佳的人选应该是先征者（患癌者），他是最有可能携带基因突变的那个人；或者家系中的肯定携带者，比如某个个体的父母和子女中有人曾患某种综合征相关肿瘤。✦ 如果家系中患者去世（或不能检测），应先检测该家系中患者的直系亲属。其实，从遗传学角度来看，检测的目的是确定家系肿瘤的潜在原因，也就是为了得到阳性检测结果。检测一个 50% 风险携带基因突变的个体比检测有 12.5% 几率携带突变的表亲更有意义！✦ 如果家系同时患癌，一般建议检测肿瘤发病年龄最小的成员。不过对于儿童检测应更谨慎，对儿童检测成年发病的遗传性肿瘤综合征很少能得到任何医疗益处。✦ 如果个人和家族病史可能提示可检测两个或更多不同的肿瘤综合征（个人和家族史的偏向性不一样），这时候一般建议同时检测多种肿瘤综合征，查出答案的可能性更大些。遗传性肿瘤基因检测的流程对于专业内的人士并不陌生，对于大众来说可能就是比较高大尚的东西，整体的步骤为：知情同意书 → 申请表 → 签字 → 付款 → 样本采集（唾液/血

根据陆国辉老师《临床遗传咨询》一书，遗传性肿瘤主要有如下特点：家族里同时出现多个患有相同或者相互间关系密切的肿瘤的病人：比如，亲人中既有患乳腺癌的，又有患卵巢癌的。发病年龄小：一般我们认为50岁以上患的肿瘤更倾向于是散发的（非遗传性的），若有家属50岁之前得了恶性肿瘤，应该更加重视。常染色体显性遗传模式：也就是说，肿瘤病人在家族里大多呈纵向分布，即从上一代往下一代传递。罕见肿瘤的出现：肿瘤在异常人群里出现，说明患遗传性肿瘤可能性大，例如男性患了乳腺癌。多个或者双侧肿瘤的出现：比如双侧乳腺癌，双侧肾癌，双侧视网膜母细胞瘤。多个原发性肿瘤在同一个病人身上出现：如一个患者既有原发性肠癌，又有原发性卵巢癌。非肿瘤临床表现的出现：如Cowden综合征，该疾病是一种罕见的常染色体显性遗传病，主要表现为多重错构瘤及某类肿瘤发生风险的增加。临床表现多种多样，包括乳腺癌、子宫内膜癌、甲状腺癌等，皮肤方面表现为口腔及皮肤乳头状瘤，胃肠方面表现为混合性息肉（包括错构瘤）。无外环境风险因素的发现：一般我们认为肿瘤是复杂疾病，肿瘤的发生是遗传因素与环境因素（包括与致癌物质的接触）共同作用的结果。外环境条件不存在

据估计，人类中约有5%~10%肿瘤是由于某些基因的种系变异（胚系突变）遗传而发生的。虽然这些肿瘤在肿瘤总负荷中所占比例不大，但对于携带这些种系变异的个人和家族来说，危害几乎是100%的！几乎是100%的！几乎是100%！（重要的事情说三遍！）因此，对特定的高危人群和个体进行变异基因检测，并对携带者进行有效的防治和干预，是现在肿瘤医学的重要发展趋势。所以，对于那些有家系肿瘤史，可能会有阳性检测结果者就有必要进行特定的遗传性肿瘤综合征基因检测。

遗传性肿瘤相关基因的解读是根据国际癌症研究机构（IARC）､美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）和胚系突变等位基因解读实证联盟（ENIGMA）等给出的分类等级： 很多人在咨询做遗传性肿瘤基因检测时都有这样的疑虑：如果检测到携带遗传易感基因就一定得肿瘤吗？如果没有就肯定不会得肿瘤吗？其实，并不是携带了遗传性肿瘤的易感基因，就 100% 得肿瘤，遗传性肿瘤基因检测的重点在于针对性地预防。遗传性肿瘤患者有 50% 的概率会遗传给后代，如果是有家族史的健康人群，做基因检测可以帮助他们了解自己是否有罹癌风险。若不幸结果是阳性，那么就要针对性的预防相关肿瘤的发生；如果是阴性的结果，就不用过多的担心。但阴性结果并不意味着就肯定不会得肿瘤了，因为肿瘤的发生也受后天因素的影响，环境、生活习惯等等也与肿瘤的发生有关，所以，保持一个好的生活习惯很重要。

用钩镊再眼眶处固定大鼠颅骨，用组织剪再颅骨和颈椎连接处剪断。 组织剪头部伸入枕骨大孔，尽量贴着骨头。 组织剪从枕骨大孔处伸入，朝向同侧眼眶方向，贴着骨头剪，剪到眼眶。 右侧同上 从大鼠眼眶之间剪断 左手持钩镊插入大鼠的眼眶固定颅骨（有点残忍），用弯钳直接夹住枕骨大孔处的骨头，直接就掀起来了，完整的脑组织就显现出来了，下图为灌注后的脑组织。 从小脑处将脑组织向上推起，用小剪刀剪断脑神经。最后向为医学献身的动物们致敬！

网友eming43的经验支原体的检测． PCR法原理 该法是通过PCR技术将支原体16srRNA基因特异性扩增，来检测培养细胞中污染的支原体。PCR引物选自16sr RNA基因上的支原体特异片段，此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，经溴乙啶（EB）染色后在紫外透射仪上进行检测。u 16sr DNA引物用水稀释至40umol/L。　　（1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’　　（2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’2) PCR扩增（1） 在冰浴中对各样品制备PCR重要混合物，对每个样品均加入：　　10X PCR缓冲液 5.0ml　　25mmol/L dNTPs 混合物 0.4ul　　40umol/L 16sr DNA引物 每种引物1.0ul　　40umol/L pBR322 DNA 引物 每种 2.0ul　　pBR322 DNA 1pg/ml 2.0ul　　DNA聚合酶（5U/ml） 0.2ul　　三蒸水 35.4ul　　总量 45ul（2） 用无菌去离子水稀释样品为1:

污染测试--支原体 :PCR方法原理：利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。特点：灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组，避免可能之污染。缺点︰PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。材料与设备：ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.　　提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture　　positive control DNA (A. laidlawii ; M.

最近看大家常提到支原体污染，就翻了翻书，做了些笔记，现在贴出来和大家分享： 支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0.2um)并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性。可为圆形、丝状或梨形。 支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构。其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。 支原体代谢需固醇类物质、部分种类需要精氨酸、O 2或葡萄糖，每一种支原体都有自身持点。多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7.6—8.0)，对酸耐受性差。对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 支原体污染细胞后。培养液可不发生混浊。多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解。因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢。甚至从培养器皿脱落。 为确定有无支原体污染可做如下检酗： ①相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察。支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间