简介
利用 Histopaque-1119 和 Histopaque-1077 构建的不连续密度梯度离心法，是提取小鼠骨髓或外周血中中性粒细胞的经典方案。
原理
该方法利用不同细胞的比重（Density）差异进行分离：
- Histopaque-1077 (密度 1.077 g/mL)： 主要用于阻拦单核细胞、淋巴细胞（外周血单个核细胞, PBMC）和血小板。这些细胞比重较轻，会停留在 1077 层上方。
- Histopaque-1119 (密度 1.119 g/mL)： 中性粒细胞的比重介于 1.077 和 1.119 之间。离心时，中性粒细胞会穿过 1077 层，但被 1119 层拦截。
- 红细胞层： 红细胞比重最大（>1.119），会沉淀在最底部的管底。
目标细胞层的位置
在离心结束后，你会看到明显的界面分层：
- 最上层（血浆/稀释液）： 含有血小板。
- 第一界面（稀释液与 1077 之间）： 主要是单核细胞和淋巴细胞。
- 第二界面（1077 与 1119 之间）： 这是你的目标层，含有高纯度的中性粒细胞。 Sigma-Aldrich 官方方案 详细描述了这一层级结构。
- 底层（1119 以下）： 主要是红细胞
材料与仪器
PBS、Histopaque-1119、Histopaque-1077、离心机、PBMC、离心管、移液器
步骤
- 用含有 2mM EDTA 的 PBS 稀释外周血 1：2。
- 在每个 50ml 管中，仔细并顺序地放置10ml Histopaque-1119,10ml Histopaque-1077和25ml稀释的血液。
注意：Histopaque 在使用前应该达到室温。 - 在室温下离心 30 分钟，在700℃离心（注意：不断裂。）。
- 将 Histopaque-1077 和 Histopaque-1119 的界面上的层转移到新的 50ml 管（通常的体积范围为 2-3ml）中，用 PBS 加至 50ml，并以 300xg 离心 > 室温 10 分钟。
- 用 30 ml PBS 再次洗涤。
注意：来自健康供体的每 ml 外周血的嗜中性粒细胞的平均产量预计为 2-5 百万个细胞。
注意事项
- 室温操作： Histopaque 试剂和样本应提前平衡至室温（20-25°C），因为密度受温度影响很大。
- 液面平稳： 铺层时必须极其缓慢，保持界面清晰，切勿晃动。建议使用 Thermo Fisher 的移液技巧指南 中提到的壁挂法。
- 关闭离心机刹车 (No Brake)： 离心结束时的降速必须非常缓慢，否则剧烈的刹车会搅浑已经分好的细胞层。
- 后续除红： 尽管 1119 能去除大部分红细胞，但收集到的中性粒细胞层中可能仍残留少量红细胞。通常需要配合短时间的 ACK 裂解液 处理。
常见问题
细胞产量（Yield）低
问题原因分析：
- 温度不当： Histopaque 在冷藏状态下比重会发生变化，导致细胞无法正确沉降到目标层。
- 起始细胞量不足： 小鼠外周血中中性粒细胞占比极低（约 10-20%），若样本量太小，很难看到明显的界面层。
解决方案：
- 提前回温： 实验前将 Histopaque 试剂在室温（18-26°C）下平衡至少 1 小时，确保密度准确。
- 增加来源： 若实验对纯度要求极高且需要大量细胞，建议从骨髓中提取（通常每只小鼠可获 6-12 × 10⁶ 个细胞）。
细胞纯度（Purity）低（污染严重）
问题原因分析：
- 界面混合： 加样或搬动离心管时动作剧烈，导致 1077 和 1119 两层试剂发生扩散混合，失去了密度梯度效果。
- 离心刹车过快： 强力刹车会产生湍流，将已经分层的细胞重新混匀。
解决方案：
- 缓慢加样： 铺层时倾斜离心管，沿着管壁极其缓慢地加入每一层液体，保持界面如镜面般清晰。
- 关闭刹车 (No Brake)： 离心机必须设置为“升速慢、无刹车（Brake Off）”模式降速。
- 现配现用： 密度梯度层应在加样前即刻铺设，避免放置过久导致两层溶液相互渗透扩散。
红细胞（RBC）污染严重
问题原因分析： 1119 层虽能阻拦红细胞，但大量红细胞沉降时可能包裹部分中性粒细胞，或有少量残留随界面被吸出。
解决方案：
后续裂解： 收集目标层后，配合短时间的 ACK 裂解液 处理（约 30-60 秒）或使用无菌 H₂O 进行低渗裂解 20 秒，以去除残余红细胞。
细胞活性差或被激活
问题原因分析： 离心时间过长或在 4°C 下操作可能导致中性粒细胞预激活或死亡。
解决方案：
- 全过程控温： 密度梯度离心步骤务必在 20-25°C 室温 下进行。收集到细胞后的洗涤步骤则可以在 4°C 下进行以保持细胞状态。
- 快速操作： 中性粒细胞半衰期极短，离开体外后应尽快完成提取并用于后续实验。
来源：丁香实验
