小鼠心脏灌流解离制备高质量心肌细胞

借助 gentleMACS 灌流技术，可在 gentleMACS Octo 八通道带加热全自动组织解离器上完成小鼠心脏的原位灌流。灌流过程中，心脏灌流试剂盒中的酶组合降解细胞外基质，破坏组织完整性。随后将灌流后的心脏转入 gentleMACS C 管，经短暂机械解离，即可得到高活性的单细胞悬液。最后通过 MACS SmartStrainer 100 μm 过滤，去除残余组织块，所得细胞可立即用于下游实验（分选、培养、功能/分子分析）。

1. 试剂配制：

所有体积均以单次灌流计算；如需多次，按比例放大。

（1）复溶缓冲液（Reconstitution Buffer）

取 500 μL Buffer H (20×) + 9.5 mL 无菌水 → 10 mL

加入 1 μL Reagent C，混匀备用。

注：Buffer H（20×）易滋生细菌，建议无菌分装。首次使用前，请将 Buffer H（20×）置于 37 °C 预热至少 45 分钟，且使用前充分摇匀 Buffer H（20×）。

（2）酶复溶

所有复溶酶液 –20 °C 保存 6 个月，使用前轻柔颠倒混匀。

（3）缓冲液体系

BDM 配制：0.2 g BDM + 4 mL Buffer H (1×)，37 °C 水浴 10–20 min，每 5  min 摇晃一次，直至完全溶解。

（4）酶消化混合液（Enzyme Digestion Mix，现配现用）

一个单位灌流用量：6 mL 预热的 Equilibration Buffer + 200 μL Enzyme D + 65 μL Enzyme T + 10 μL Enzyme A，轻柔颠倒混匀，避免气泡。

2. 心脏灌流解离

（1）全程建议不间断操作。如需短暂转运，至少完成步骤 1–10（心脏结扎并离体），然后置于 4 °C MACS 组织保存液 + Reagent E (1:200) 中运输；延迟处理会降低细胞得率与活性。仅完整小鼠心脏可灌流，操作前切勿损伤心脏。

（2）gentleMACS Perfuser 2  已预设好小鼠心脏灌注参数。
  若调节器（adjuster）位置被误调，可按以下方法复位：
  2.1. 顺时针旋到底（最低位）；
  2.2. 稍回旋，使调节器刻度上的「5」对准箭头；
  2.3. 再逆时针旋转 720°（两圈）即可。

▲ 在连接 gentleMACS Perfuser 2 之前，请确认已将 常规 gentleMACS 套筒 更换为 灌注专用套筒（Perfusion Sleeve）

（3）仪器准备

       3.1 水浴 37 °C 预热；离心机预冷至 4 °C。

       3.2 预热：Pre-digestion Buffer、两管 Equilibration Buffer 于 37 °C 预热。

       3.3 将 Perfuser 2  的底座+ 盖子－夹子－格栅组件安装于 Perfusion Sleeve，确保调节器在正确位置。

       3.4 将一个加热模块  Heating Unit  置于安装好  perfuser 2  的解离通道上（安装加热模块时，切勿在未安装盖子的情况下将底座装到通道上，否则可能导致加热单元故障。）。

       3.5 用 Luer 头吸管将 8 mL 预热 Pre-digestion Buffer 转入 Perfuser 2。

       3.6 启动 gentleMACS 程序 37C_m_HPK_1（步骤见下表）。

注：缓冲需液更换， 程序每阶段后会暂停；用细长玻璃吸管 + 吸液泵手动吸弃旧液，再加新液，点击 Resume 继续。

（4）心脏手术与安装

        4.1 取下盖子－夹子－格栅组件，置于 6 cm 培养皿。

        4.2 剪约 15 cm 手术线，打一环，环径略大于心脏。

        4.3 安乐死：遵守 AVMA 指南（30–70 % CO₂）。开胸，固定肋骨，剥离心包。

        4.4 将线圈套过心脏，用弯镊将其置于心房后方，轻提心脏，拉紧线结结扎，剪去多余线头。

        4.5 将心脏置于格栅中央，左右心室分别朝向格栅两侧。

        4.6 压下夹子，使心脏固定于 grid 与夹具之间。

        4.7 将盖子－夹子－格栅组件重新装回 Perfuser 2 底座。

        4.8 缓慢逆时针旋转盖子直至「▼」对准底座「▼」，lid 下沉。

        4.9 顺时针旋紧，使「▼」对准「▲」，锁定 Perfuser 2。

        4.10 点击Resume继续Initial perfusion；立即逆时针旋转调节器一整圈（约 360°）。

        4.11 Washing阶段：程序自动暂停 3 次，每次手动吸弃旧液，加入 8 mL 新鲜 Pre-digestion Buffer，再 Resume。

        4.12 最后一次洗涤后，吸弃 Pre-digestion Buffer，加入 8 mL Equilibration Buffer。

        4.13 Resume → Equilibration 30 s。

        4.14 Equilibration 期间，按前文配制酶消化混合液 Enzyme Digestion Mix（6 mL）。

        4.15 Equilibration 结束后，吸弃缓冲液，加入 6 mL 酶消化混合液。

        4.16 Resume → Enzymatic perfusion 15 min。
                ▲ 程序结束后勿丢弃该酶消化混合液，后续步骤需再次使用。

3. 组织转移与机械解离

（1）取下加热模块，连同 Perfuser 2 一并取下。

（2）旋开盖子，将盖子－夹子－格栅组件置于培养皿。

（3）将前面步骤从底座中收集的用过的酶消化混合液倒入 gentleMACS C 管（留作后续解离液），弃底座。

（4）用镊子推起夹子，将心脏从格栅移至培养皿。

（5）丢弃盖子及夹子－格栅组件。

（6）去除心脏上缝线，将心脏转入装有用过的酶消化混合液的 C 管。

（7）拧紧 C 管盖子，将其倒置插入 gentleMACS 解离通道中

▲此处确保通道安装的是常规的套筒（Sleeve）而不是灌流套筒（Perfusion Sleeve）

（8）运行程序 HPK_CR_1（以孵育为主，极少旋转）。

▲ 手动机械法解离会降低细胞得率及活性。

4. 过滤、收集与终止

（1）取 15 mL 离心管置冰上，顶部放 100 μm 细胞滤筛。

（2）程序结束后取下 C 管。

（3）开盖，将细胞悬液转移至滤网，避免产生气泡。

（4）用 4 mL Stop Buffer冲洗 C 管，一并倒入滤筛。

（5）4 °C，140 × g，离心 1 min，完全弃上清（上清可进一步富集非实质细胞）。

（6）轻弹管壁使沉淀松散。

（7）用 5 mL Stop Buffer 重悬细胞，轻柔颠倒混匀。

（8）置于冰上，立即进行下游实验。