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        酶类_来自高温厌氧杆菌属的丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶的纯化

        相关实验:蛋白质的层析纯化

        最新修订时间:

        简介

        研究背景:

        Wood-Ljungdahl pathway (WLP) 作为一种古老的碳固定通路,它依赖严格的厌氧微生物产乳酸菌、产甲烷菌、硫化菌和古生菌。在WLP途径中CO/CO₂和氢气为碳源和能源, 合成乙酰辅酶A(acetyl-CoA), 进行物质和能量代谢

         (acetyl-CoA。产乙酸菌再转化为乙酸。大多数产乙酸菌可以维持无机自养的生命循环,使用H2和CO作为电子供体固定CO2生成乙酸。

        WLP途径的ATP得失为零,因此根据化学渗透假说,它们需要能量的转化来维持细胞代谢的平衡。自养代谢和异养代谢的中心环节就是乙酰辅酶A。2个关键酶作用于这一环节,分别是一氧化碳脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶 (CODH/ACS),结合了WLP途径中的甲基和CO,而丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶 (PFOR) 可以还原乙酰辅酶A羧酸盐到丙酮酸。

        PFOR是细菌厌氧代谢的关键酶,从低电势的铁氧还蛋白 (Fd2) 作为电子载体,此酶可以用作酶促反应的辅酶,在需要Fd作为电子受体的反应中,比如电子差异酶,以维持还原性Fd的恒定水平。

        原理

        酶类_来自高温厌氧杆菌属的丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶的纯化

        图2 T.Kivui中表达非标签&带his标签PFOR基因纯化流程图

        材料与仪器

        酶类_来自高温厌氧杆菌属的丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶的纯化

        步骤

        实验方法:

        在66℃的厌氧条件下培养T. kivui菌,优化微量元素,通H2和N2。收集细胞破碎130,000 g离心,4℃ 60 min收集上清。

         

        在T. kivui中重组表达non-tagged PFOR和His-tagged PFOR1纯化路线。

        PFOR透析到50 mM Tris-HCl,2 mM DTE,4 μM resazurin,20% (v/v) glycerol,pH 8.0进行阴离子交换层析捕获。3-13 mM NaCl 或电导3.8–8.4 mS/cm洗脱。样品加入1 M AMS进行疏水相互作用层析中度纯化,50 mM Tris-HCl,20 mM MgSO4,2 mM DTE,4 μM resazurin,20% (v/v) glycerol,pH 7.5线性洗脱。50 kDa VIVASPIN 超滤浓缩,衔接凝胶过滤进行精细纯化,50 mM Tris-HCl,150 mM NaCl,20 mM MgSO4,2 mM DTE,4 μM resazurin,20% (v/v) glycerol,pH 7.5,获得单峰。

        PFOR1捕获步骤为镍柱亲和层析,30 mM imidazole洗杂,50 mM Tris-HCl,150 mM NaCl,20 mM MgSO4,400 mM imidazole,0.5 mM DTE,4 μM resazurin,20% (v/v) glycerol,pH 7.5洗脱,超滤后衔接凝胶过滤精纯。

         

        非标签PFOR纯化倍数为50.4,三步纯化的回收率3.6%。His标签PFOR1的纯化倍数为35.8,两步纯化的回收率为93.9%。

         

        Reference:

        Katsyv et al. Pyruvate:ferredoxin oxidoreductase of Thermoanaerobacter kivui. FEBS Open Bio 11 (2021) 1332–1342

         

        内容来源:Cytiva

        来源:丁香实验

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