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        体外转录法合成 dsRNA

        相关实验:dsRNA 的制备

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 杨晶晶硕士

        公共卫生 福建医科大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 于涛博士

        生物化学分子生物 中国科学院大学

        原理

        根据靶基因的 DNA 模板在体外转录形成两条互补 RNA 链,随后将所得的 RNA 链退火形成 dsRNA。

        用途

        沉默靶基因,靶基因下游调控研究。

        材料与仪器

        试剂:

        琼脂糖凝胶、电泳缓冲液、ATP、CTP、GTP、UTP、DTT、DNA marker、OTT、高保真 PCR Mix 、dNTP 混合液、无水乙醇、DNA 上样缓冲液(6X)、TBE(5X)、RNase free water、引物、PCR 缓冲液、PCR 管、各规格无酶 EP 管、苯酚 : 氯仿(1 : 1)、DNA 酶 I、乙酸钠、Gold View 核酸染色剂、T7 聚合酶、T7 转录缓冲液(10X)、全基因组 DNA。

        设备:

        核酸电泳仪、PCR 仪、金属浴、凝胶成像系统。

        步骤

        一、制备模板

        1、查阅基因序列库、下载目的基因的序列。

        2、选择长度为 400~800 bp 的目的基因序列作为体外转录的模板。

        3、将序列进行 BLAST 比对,分析其特异性,特异性不好则需要重新选取。

        4、用 Primer5.0 设计目的基因的引物。

        5、将 T7 启动子序列(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)加到两条引物的 5' 端,需要准备两队引物分别带有 T7 启动子序列或者不带。

        6、分别用每对引物进行 PCR 合成 DNA 模板,在 200 μl 的 RNAse free 的 EP 管中配置 PCR 体系:

        模板 DNA

        基因组 DNA:6 ug

        RNase Free dH2O

        Add to 100 μl

        SYBR Taq 酶(2×)

        50 μl

        正向引物(10 μM)

        5 μl

        反向引物(10 μM)

        5 μl

        总反应体积

        100 μl

        7、混匀后涡旋离心到管底,放入 PCR 仪中,进行如下扩增:

        Cycle

        Cycle Point

        Hold 94 ℃,5 min

         

        Cycling(25 repeats)

        Step1:94 ℃,hold 30 s

         

        Step2:64 ℃,hold 30 s

         

        Step3:72 ℃,hold 10 s

        Hold 72 ℃,5 min

         

        Hold 72 ℃,5 min

         

        8、制备 1% 的琼脂糖凝胶电泳

        9、反应结束后将 5 μl 的 PCR 产物与 1 μl DNA 缓冲液(6X)混匀,然后加到上样孔中进行电泳。

        10、将剩余的 PCR 产物转移至一个新的 800 μl EP 管中,加入 1/10 体积的乙酸钠(3 mol/L,pH 5.2)和 2.5 倍体积的无水乙醇,涡旋混匀,在 -20 ℃ 或者更低的温度下放置 30 min 以上,使 PCR 产物沉淀。4 °C 16 000 g 离心 30 min,弃去上清。用 1 ml 70% 乙醇洗沉淀以去除残留的盐类。4 ℃ 16 000 g 离心 5 min,尽量去上清,然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。

        11、将 DNA 沉淀溶解于 50 μl 水。

        二、制备 dsRNA

        1、将 T7RNA 聚合酶置于冰上,按下表配置 100 μl 体外转录体系:

        RNase Free dH2O

        56.5 μl

        T7 转录缓冲液(10X)

        10 μl

        PCR 模板 DNA

        5 μl

        ATP ( 100 mmol/L)

        5 μl

        CTP ( 100 mmol/L)

        5 μl

        UTP ( 100 mmol/L)

        5 μl

        GTP ( 100 mmol/L)

        8 μl

        OTT (1 mol/L)

        0.5 μl

        T7RNA 聚合酶

        0.5 μl(100 U)

        2、将试剂离心到 EP 管底部,37 ℃ 孵育 120 min。

        3、加入 5 μl DNA 酶 I,涡旋将其离到管底,37 ℃ 孵育 30 min。

        4、加入等体积的酚 : 氯仿(1 : 1),涡旋 30 s。4 ℃ 最大转速离心 15 min,将上层液相转移至一个新的 1.5 ml 微量离心管中。

        5、向液相中加入 1/10 体积的乙酸钠(3 mol/L,pH 5.2)和 2.5 倍体积的无水乙醇,涡旋混匀,在 -20 ℃ 放置 30 min 以上,使 PCR 产物沉淀。4 ℃ 16 000 离心 30 min。

        6、弃去上清。加入 1 ml 70% 乙醇洗涤沉淀,以去除残留的盐类。4 ℃ 16 000 离心 5 min 使 RNA 沉淀,最大限度地弃去上清(70% 乙醇),然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。

        7、将 RNA 沉淀溶解于 100 μl 的无核酸酶水中。利用 Nanodrop 测量 RNA 的浓度和纯度。

        8、使两条链复性,生成 0.5 μmol/L 的 dsRNA 溶液:

        9、将 EP 管放在金属浴上 95℃,1 min,自然冷却至室温。

        10、向液相中加入 1/10 体积的乙酸钠(3 mol/L,pH 5.2)和 2.5 倍体积的无水乙醇,涡旋混匀,在 -20 ℃ 放置 30 min 以上,使 PCR 产物沉淀。4 ℃ 16 000 g 离心 30 min。弃去上清。加入 1 ml 70% 乙醇洗涤沉淀,以去除残留的盐类。4 ℃ 16 000 g 离心 5 min 使 RNA 沉淀,最大限度地弃去上清(70% 乙醇),然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。

        11、用 RNase free water 溶解 RNA,置于 -80 ℃ 保存备用。

        三、dsRNA 完整性检测

        1、制备 1% 的琼脂糖凝胶电泳

        2、反应结束后将 5 μl 的 PCR 产物与 1 μl DNA 缓冲液(6X)混匀,然后加到上样孔中进行电泳。

        3、将凝胶取下,在中 Gold View 核酸染色剂进行显色,然后在 1X TBE 中漂洗 3 次,每次 5 min,上机进行检测。

        注意事项

        1、提 RNA 时浓度太低,可以在提取过程中适当加长沉淀时间,沉淀过夜,或者加微量糖原。

        2、检测 dsRNA 完整性过程发现有其他条带,可能是 RNA 降解或者转录出来的 RNA 不特异。

        3、目的基因序列不宜过长,否则特异性降低,容易会产生杂带污染。

        常见问题

        问题 1:提 RNA 时浓度太低?

        答:可以适当提高模板浓度,延长体外转录时间,以及在提取过程中适当加长沉淀时间,沉淀过夜。

        问题 2:dsRNA 完整性检测过程中发现杂带?

        答:实验耗材均采用无 RNA 酶试剂、EP 管、移液器吸头,避免降解目的 dsRNA。

        来源:丁香实验

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