🔥 m6A 甲基化修饰水平测定

原理类似于 Elisa 检测，将目标 RNA 与 包被 m6A 抗体的板孵育，然后洗脱，只有和板中 m⁶A 抗体结合才能保留下来，进行抗体信号生成反应，最后检测抗体信号。

甲基化修饰。

使用 EpiQuik m⁶A RNA Methylation Quantification Kit 测定 m⁶A 甲基化修饰水平的步骤如下：

1、样品准备：利用 Trizol 法从组织或细胞中提取 Total RNA，24 孔板每孔 200 ng；

2、试剂配制：将 WB（Wash Buffer）、CA（Capture Antibody）、DA（Detection Antibody）、ES（Enhancer Solution）进行稀释；

3、RNA 结合：取出所需 strip 条，剩下的包裹好放入 4 ℃，每孔加入 80 μL BS（Binding Solution）然后依次加入 1 μL NC（Negative Control），1 μL PC（Positive Control），1 μL SP（Sample），轻轻摇晃混匀，用保鲜膜封住孔，37 ℃ 孵育 90 min；

4、除去每孔中的 BS，加入 150 μL 稀释的 Wash Buffer，然后用枪吸走，共洗三遍；

5、m⁶A 捕获

a．每孔加 50 μL 稀释的 CA，室温孵育 60 min；

b．吸去孔中的 CA，加 150 μL WB，用枪吸走，一共洗 3 遍；

c．每孔加 50 μL DA，室温孵育 30 min；

d．吸去孔中的 DA，加 150 μL WB，用枪吸走，一共洗 4 遍；

e．每孔加 50 μL ES，室温孵育 30 min；

f．吸去孔中的 ES，加 150 μL WB，用枪吸走，一共洗 5 遍；

6、信号检测

a．每孔加 100 μL DS，避光室温孵育 1 h 10 min；

b．每孔加 100 μL SS，颜色变黄，2 min 15 s 内在 450 nm 处测定吸光度。

加样、洗脱要精确，避免孔与孔之间的差异。

复孔差异较大。