DCFHDA 检测细胞内总活性氧

应用荧光探针 DCFHDA 检测细胞内总 ROS 水平，DCFHDA 探针本身不带荧光，可以自由穿过细胞膜，其进入细胞后，在细胞内酯酶的作用下被水解成 DCFH，DCFH 不能穿过细胞膜，因而滞留在细胞内，之后由 ROS 介导的氧化生成荧光物 DCF（激发波长 λex = 485 nm，发射波长 λem = 530 nm）。因此，可以通过检测 DCF 的荧光强度评估细胞内 ROS 的水平。

（1）准备待检测细胞，计数细胞，调整细胞数量为 1×10⁶ 个/mL；

（2）PBS 润洗三次，加入新鲜 DMEM 培养基（根据细胞选择合适培养基）；

（3）加入终浓度为 0.5 μM 的 DCFHDA 探针，室温下避光孵育 30 min；

（4）PBS 润洗三次，去除细胞外残留 DCFHDA 探针；

（5）加入无酚红 DMEM 培养基（根据细胞选择合适培养基），流式细胞仪检测。使用 488 nm 激发波长，525 nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

（1）实验前 30 min 对细胞间及超净台进行充分紫外照射；

（2）进入细胞间更换无菌衣，无菌拖鞋等；

（3）保证细胞数量 1×10⁶ 个/mL，便于后续观察统计；

（4）孵育过程全程避光，每隔 3～5 min 轻柔颠倒混匀，使探针与细胞充分接触；

（5）孵育结束后，PBS 充分润洗，无酚红培养基重悬细胞；

（6）荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。