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        🔥 DNA 定点突变

        相关实验:DNA 定点突变实验

        别名:site-directed mutagenesis

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 周柏博士

        临床医学八年制 中南大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 李娜硕士

        生理学 大连医科大学

        简介

        基因定点突变是指向目的 DNA 片段中插入、缺失或点突变一个或多个碱基以改变基因的序列,进而突变某个氨基酸。

        用途

        基因定点突变常用于基因研究,该方法能快速、高效提高目的蛋白的性状和表征,以便于研究目蛋白的结构及功能特性。

        材料与仪器

        一、同源重组法

        (南京诺唯赞生物科技股份有限公司的Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 试剂盒)

        材料:诺唯赞 Mut Express® II Fast Mutagenesis Kit V2 试剂盒、ddH2O、PCR 管、感受态细胞、PCR 仪、摇床等

        二、一管式突变试剂盒

        一管式突变试剂盒的使用方法比较简单,不需要重组环化大的过程,真的一管就可以实现环状质粒的突变。

        材料:一管式突变试剂盒、ddH2O、PCR 管、感受态细胞、PCR 仪、摇床等

        步骤

        一、同源重组法

        ①突变引物设计

        引物设计的原理是选择包括突变位点在内的15-21bp互补片段,然后在两段再选择至少15bp非互补片段。反向互补区域GC含量40%~60%为佳,且应该避免选择有重复序列的区域。

        🔥 DNA 定点突变

        别担心,官网(https://crm.vazyme.com/cetool/singlepoint.html)可以帮你进行设计:

        🔥 DNA 定点突变

        点击左下角「生成Mut Express II单点突变扩增引物」,可自动生成两条所需引物,交由公司合成即可。

        ②目标质粒扩增

        在①中获得的引物按照如下反应体系扩增,其中Phanta为一种DNA聚合酶。

        🔥 DNA 定点突变

        推荐使用 ≤1 ng新鲜提取的质粒作模板,需要将质粒稀释较大的倍数才可以得到这么低的模板浓度。在如上所述50ul反应体系中,ddH2O与质粒的总体积为19ul。

        推荐PCR反应条件如下。退火温度一般设置为引物Tm值。为避免引入非目标突变,扩增数应小于35,若扩增效率良好,扩增数最好小于30。

        🔥 DNA 定点突变

        反应结束后,可取少量扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。如目标质粒条带单一且位于正确位置,则可认为扩增成功,可进行下步实验。

        ③扩增产物Dpn I 消化

        因②中扩增产物含有原始模板质粒,需要在进行重组环化之前将其消化,去除甲基化模板质粒(原理:模板质粒来源于大肠杆菌等细菌,在细菌中会被甲基化修饰,而通过 PCR 扩增的质粒则不含有甲基化修饰。甲基化酶Dpn I酶可以消化掉质粒模板而不消化PCR生成的产物。这也要求我们必须使用甲基化酶无缺陷的宿主菌扩增原始质粒,如XL10、DH5α、JM109)。

        向40-50ul②中反应产物中加入1ulDpn I酶,轻轻吸打混匀,短暂离心,置于37℃恒温反应1 - 2 h。

        ④消化产物用量

        对于单碱基突变,Dpn I消化产物最适使用量 = [0.02 × 片段碱基对数] ng

        ⑤重组反应

        对于单碱基突变,推荐以下反应体系:

        🔥 DNA 定点突变

        使用移液器将上述物质轻轻吸打混匀(勿涡旋振荡!),短暂离心,将反应液收集至管底。 37℃,30 min,然后立即置于冰上冷却。

        注意:

        反应体系应在冰上配置;

        扩增模板量过高或Dpn I 消化不完全易造成较高的假阳性背景,因此推荐设置阴性对照。

        ⑥重组产物转化

        在冰上解冻克隆感受态细胞,取 10 μl 重组产物加入到 100 μl 感受态细胞中,轻弹管壁混匀(勿涡旋振荡!);

        冰上静置 30min,随即 42℃ 水浴热激 45sec,再立即置于冰上冷却 2~3min。

        用无菌涂布棒将菌液在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。37℃ 培养箱中倒置培养 12~16h;

        若重组反应转化平板上的克隆数目显著高于阴性对照,可挑取若干个单克隆接种至含有适当抗生素的 LB 液体培养基中培养过夜,提取质粒进行一代测序。

        二、一管式突变试剂盒

        ①引物设计:同上

        ②目标质粒扩增(25ul 体系)

        根据试剂盒具体要求,添加适当体积及浓度的各种物质。扩增循环数、扩增速度等可参考「同源重组」法。

        ③扩增产物Dpn I 消化

        同「同源重组」法。

        ④重组产物转化

        同上述⑥

        注意事项

        点突变的操作很简单,一般第一次上手就能成!

        需要注意所加的物质比较多,比如加样后瞬时离心将物质离心到管底,以及冰上保存的试剂不要放在室温保存。

        目标质粒扩增所需要的模板量非常小,一定不要加多了。

        常见问题

        如果同源重组法的步骤②中的条带具有非特异性,可以根据 marker 的位置进行胶回收,再进行后续的实验

        来源:丁香实验

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