外泌体提取纯化（尿液）

一、样品预处理

1、取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后 于 25 ℃ 水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

2、样品初始用量：单次提取时的尿液量建议不低于 20 mL

3、离心去细胞碎片：将样品转移至离心管中，于 4℃ 以 3,000 ×g（~5,200 rpm）离心10 min，去除样品中的细胞碎片（注：若沉淀较多，可 3,000 ×g，10 min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）；

 10 cm 有效离心半径的大离心机换算（≥15 mL 离心管），下同。

4、离心去杂质碎片：将离心上清液转移至新的离心管中，于 4℃ 以 10,000 ×g（~9,500 rpm）离心 10 min，去除样品中的杂质碎片；

5、样本过滤：去除杂质碎片的离心上清液转移到 50 mL 离心过滤柱中，于 4℃ 以 3,000 ×g（~5,200 rpm）离心 10 min，取过滤柱下室液体（注：若上室中有残留液体，可重复本步骤以获得更多样本量）；

6、上清液转移：去除杂质碎片的上清液转移到新离心管中。

二、提取外泌体

1、上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中加入 Exosome Concentration Solution（ECS 试剂），具体的加入剂量为每 20 mL 尿液加 4 mL ECS 试剂；

2、溶液混合：加入 ECS 试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀 1 min，再放置于 4℃静置 ８h 以上（注：增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过 24h）；

3、沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4℃ 以 10,000 ×g（~9,500 rpm）离心 60 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒（注：尽可能吸尽上清液）；

4、再次离心：将含有沉淀的离心管再次于 4℃ 以10,000 ×g（~9,500 rpm）离心 2 min，弃上清（注：尽可能吸尽上清液）；

5、外泌体重悬：取合适量的 Exosome Solution Buffer（ESB 试剂）均匀吹打离心沉淀物，待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中（建议每 20 mL 尿液用 200 μL 左右 ESB 试剂重悬）；

6、收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4℃ 以12,000 ×g（~12,400 rpm）离心 2 min，保留上清液，其中富含外泌体颗粒（注：若沉淀较多，可 12,000 ×g，2min 离心多次至无明显沉淀，每次取上清液）。

 7 cm 有效离心半径的小离心机换算（≤2 mL 离心管）。

7、外泌体的保存：纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻存于 -80℃ 低温冰箱中，以备后续实验使用。