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        基于 FRET 的 HIV-1 病毒粒子的融合试验

        相关实验:基于荧光共振能量转移的 HIV-1 病毒的融合分析实验

        最新修订时间:

        简介

        基于病毒粒子的融合试验分为 3 个步骤:①将含有 BlaM-Vpr 的 NL4-3 导入细胞;②用 CCF2-AM 基质培养细胞用于 Blam 反应;③免疫标记和固定。

        材料与仪器

        器材:96-孔 V 型底培养板(Corning Incorporated,康宁,纽约)、离心机等。

        试剂:

        ①外周血淋巴细胞。

        ②RPMI 培养液:10% 胎牛血清,100U/mL 青霉素,和 100 μg/mL 链霉素。

        ③CCF2-AM 底物和β-内酰胺加载液(PanVera,麦迪逊,威斯康辛州)。

        ④无 CO2 培养基(GibcoTM-Invitrogen 公司,卡尔斯巴德,加州)。

        ⑤丙磺舒(Sigma,圣路易斯,密苏里州)。

        ⑥荧光激活细胞分选仪(FACS)染色缓冲液:1x 含 2% 胎牛血清 PBS,4℃ 保存。

        ⑦APC 标记的鼠抗人 CD3 抗体,PE 标记的鼠抗人 CD4 抗体,APC-Cy7 标记的鼠抗人 CD8 抗体(BD Biosciences,圣何塞,加州)。

        ⑧ 16% 多聚甲醛(电子显微镜科学公司,华盛顿堡,宾夕法尼亚州)

        步骤

        基于 FRET 的 HIV-1 病毒粒子的融合试验的基本过程可分为如下几步:

        (一)将含有 BlaM-Vpr 的 NL4-3 病毒粒子导入细胞

        A 用 RPMI 培养液洗涤外周血淋巴细胞。

        B 计数淋巴细胞并按 2x107 个细胞/mL 种入培养液。

        C 将细胞悬液按照 100μl 的等份(2x106 个细胞)加入 v-形底的 96 孔板中,其中包括 4 孔用于基于 FRET 的 HIV-1 病毒颗粒融合检测时免疫染色补偿调节的对照(见小标题(三))。

        D 加入相当于 400ng p24 含有 BlaM-vpr 的 NL4-3 的病毒粒子,37℃ 培养 2 h。

        (二)靶细胞加载 CCF2-AM 底物进行的 BlaM 反应

        A 根据下述 PanVera 的方案准备 1 mL 的加载溶液。

        a.用二甲基亚砜将 CCF2-AM 重悬,配成 1 mM 的贮存液,分成等份贮存于-80℃。

        b.用涡旋振荡混合仪将 1 mM CCF2-AM1μl 和 9μl 含 100 mg/mL 的 Pluronic-F127 以及 0.1% 柠檬酸的液体混合(含 CCF2-AMB 液配方由 PanVera 提供)。

        c.加入 1 mL 的无 CO2 的培养基再次混匀。

        B 配置 1 mL 反应液(2.5 mM 丙磺舒,含 10% 的胎牛血清的无 CO2 培养基)。

        a.将丙磺舒(250 mM)溶于 250 mM 的 NaOH 中配成贮存液,分装后冻存于-20℃。

        b.将 10μl 丙磺舒存贮液加到 1 mL 无 CO2 培养基中稀释。

        c.加入 100μl 胎牛血清。

        d. 涡旋震动混匀。

        C 室温 800 g 离心 5 min 收集细胞。

        D 用 200 μl 的无 CO2 培养基洗涤细胞,于室温 800 g 离心 5 min。

        E 100 μl CCF2-AM 加载液重悬细胞沉淀,暗处室温孵育 1 h。

        F 室温离心 800 g5 min 收集细胞。

        G 用 200μl 的反应液洗细胞,室温 800 g 离心 5 min。

        H 用 200μl 反应液重悬细胞沉淀,室温暗处孵育 16 h。

        (三)免疫染色与固定

        基于 FRET 的 HIV-1 融合试验可以通过免疫染色来确定具体 HIV 病毒感染的细胞群(见注释 4.7),当分析细胞系或已经经过纯化的细胞时此步可以被省略。比如,基于 FRET 的 HIV-1 融合试验后可以用 APC 耦联的抗人 CD3 抗体,PE-Cy7 耦联的抗人 CD4 抗体,APC-Cy7 耦联的抗人 CD8 抗体进行免疫染色。用负载了 CCF2-AM 和上述每种荧光抗体单染的未被感染来作补偿设置。

        A 4℃ 离心 800 g 5 min 收集细胞。

        B 用 200μl 流式细胞染色缓冲液洗涤。

        C 4℃ 800 g 离心 5 min 收集细胞,加 50μl 染色缓冲液,其中含有 1:100 稀释的抗 CD3-APC,1:50 稀释的抗 CD4-PE-Cy7 和 1:50 稀释的抗 CD8-APC-Cy7。对于 4 种补偿对照,用流式染色缓冲液、1:100 稀释的抗 CD3-APC,1:50 稀释的抗 CD4-PE-Cy7;1:50 稀释的抗 CD8-APC-Cy7(见注释 4.8)。

        D 4℃ 放置 30 min。

        E 4℃ 离心 800 g 5 min 收集细胞。

        F 用 200μl 染色缓冲液洗涤细胞 2 次。

        G 用 1.2% 的多聚甲醛 4℃ 固定细胞 2 h。

        来源:丁香实验

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