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        TTC法测定根系活力

        相关实验:植物根系活力的测定

        最新修订时间:

        简介

        植物根系的活力是植物生长的重要生理指标之一。植物的根系是肥水的主要吸收器官,又是物质同化、转化和合成的器官,因此,根系的生长情况和活动直接影响植物个体的生长情况、营养水平和产量水平。本实验的目的是掌握 TCC 法测定植物根系活力的原理和方法。

        原理

        TCC 法测定植物根系活力的基本原理是 TCC 是氯化三苯基四氮唑(2,3,5-tripheyl tetrazolium chliride)的英文缩写,又名“红四氮唑”,是标准的氧化还原色素(还原前的电位为 80 mV),溶于水后呈无色的溶液。具有生活力的根在呼吸代谢过程中产生的还原物质 NADP(P)+ H+ 等,能将无色的 TTC 还原成红色的 TTF(三苯基甲臆)。其反应如下:

        TTC法测定根系活力

        生成的 TTF 不溶于水,但溶于某些有机溶剂(如甲醇和乙酸乙酯等),而且所生成的红色在空气中比较稳定(不会在空气中被自动氧化)。因此,TTC 是酶试验中被广泛应用的氢受体。TTC 还原量能表示脱氢酶活性,其颜色深浅与根系活力成正相关,并在波长 485 nm 处有最高吸收峰。因此,可用分光光度法定量测定 TTC 颜色的深浅,进而判断根系活力。根系活力的大小以其还原四氮唑的能力来表示。

        材料与仪器

        器材:分光光度计、分析天平、恒温箱、具塞刻度试管、三角瓶、量筒、移液管、烧杯、镊子、单面刀片、研钵、漏斗等。

        试剂:

        ① 植物的根系

        ② 0.4% TTC 溶液:称取 TTC 0.4 g,加入 95% 乙醇少许使其溶解,然后用蒸馏水稀释至 100 mL。

        注意事项:配好的溶液贮于棕色瓶中避光保存,若变红时不能使用,需重新配制。

        ③ 1.0% 对氨基苯磺酸:称取 1 g 对氨基苯磺酸溶于 100 mL 30% 的醋酸溶液中。

        ④ 亚硝酸钠溶液:称取 10 mg 亚硝酸钠溶于 100 mL 蒸馏水中。

        ⑤ 0.1 mol·L-1 pH7.0 磷酸缓冲液

        ⑥ 0.2 mol·L-1 pH7.0 磷酸缓冲液

        ⑦ 乙酸乙酯;

        ⑧ 保险粉(Na2S2O4);

        ⑨ 1 mol·L-1 H2SO4 溶液。

        步骤

        TCC 法测定植物根系活力的基本过程可分为如下几步:

        (一)显色

        选取长度与粗度基本一致的根,切下根系,称重,装入 50 mL 烧杯内,分别加入 0.4% TTC 溶液和 0.1 mol·L-1 pH7.0 磷酸盐缓冲液各 5 mL,充分混合,并使根尖切段完全浸入上述溶液中,置 37 ℃ 保温箱 1 h,使根尖切段显色(红色)。
        注意事项:TTC 溶液贮于棕色瓶中,避光贮存并放入冰箱中,最好现配现用。

        (二)测定

        保温时间一到,立即加入 1 mol·L-1 H2SO4 溶液 2 mL 以终止反应。取出根段,用滤纸吸干外附水分,置研钵中,加乙酸乙酯 3~4 mL 研磨(不加石英砂)。将提取的红色 TTF 小心倒入刻度试管,残渣用乙酸乙酯冲洗 2~3 次,直至洗液不带红色为止。全部洗液合并于试管中,最后用乙酸乙酯定容至 20 mL;摇匀后,以乙酸乙酯为对照,于 485 nm 下比色, 记录 OD 值。

        (三)标准曲线绘制

        取 0.4% TTC 溶液 0.4 mL,加乙酸乙酯 19.6 mL 和少量保险粉,充分摇动,所生成的红色 TTF 溶液作为已知母液。取干洁试管 6 支(1~6 号),依次加入上述母液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,再依次加入乙酸乙酯 20.0、19.0、18.0、17.0、16.0、15.0 mL,每管含 TTF 为 0、40、80、120、160、200 μg。混匀后于 485 nm 下比色,记录 OD 值,绘制标准曲线。

        (四)结果计算

        TTC法测定根系活力

        式中:W一根尖重,g;
        C一从标准曲线上查得的 TTF,μg;
        M一提取液稀释倍数;
        t一显色时间,h。

        来源:丁香实验

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