简介
植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、低温、盐碱等逆境时，游 离脯氨酸便会大量积累，并且积累指数与植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆 性的一项生化指标。本实验学习游离脯氨酸含量测定的原理和方法。
原理
植物体内游离脯氨酸含量的测定的基本原理是釆用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干 扰，快速简便，而且不受样品状态 (干或鲜样) 限制。在酸性条件下，脯氨酸与茄三酮反应生成 稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长 520 nm 处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度 的高低在一定范围内与其吸光度成正比。
材料与仪器
材料: 植物叶片，包括新鲜叶片和萎蔦叶片。
器材: 天平，分光光度计，水浴锅，漏斗，20 mL 大试管，20 mL 具塞刻度试管，5〜 10 mL 注射器或滴管。
试剂：
①3% 磺基水杨酸溶液；
②甲苯；
③2. 5% 酸性站三酮显色液；
④冰乙酸和 6 mol •L -1磷酸以 3 : 2 混合 (作为溶剂进行配制，在 4°C 下 2〜3 天有效)；
⑤脯氨酸标准溶液：准确称取 25 mg 脯氨酸，用蒸馅水溶解后定容至 250 mL, 其浓度为 100 μg • mL-1。再取此液 10 mL, 用蒸僭 水稀释至 100 mL, 即成 10 μg•mL-1 的脯氨酸标准液。
步骤
植物体内游离脯氨酸含量的测定的基本过程可分为如下几步：
(1) 取 7 支具塞刻度试管按表 45-1 加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热 40 min。
(2) 取岀并冷却后，向各管加入 5 mL 甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸 取甲苯层，以。号管为对照在波长 520 nm 下比色。
(3) 以吸光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标, 绘制标准曲线，求线性回归方程。
表 45-1 各试管中试剂加入量
| 试剂 | 管号 | ||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 标准脯氨酸量/mL | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.8 | 1.2 | 1.6 | 2.0 |
| H2O/mL | 2 | 1.8 | 1.6 | 1.2 | 0.8 | 0.4 | 0 |
续表 45-1
| 试剂 | 管号 | ||||||
| 3 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 冰乙酸/mL | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 酸性带三酮显色液/mL | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 脯氨酸含量//g | 0 | 2 | 3 | 8 | 12 | 16 | 20 |
2 •样品游离脯氨酸含量测定：
（1） 脯氨酸提取：取不同处理的剪碎混匀小麦叶片 0.2〜0.5 g（干样根据水分含量酌减）， 分别置于大试管中，加入 5 mL 3% 硝基水杨酸溶液•管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提 10 min。
（2） 测定：取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液 2 mL, 加 2 mL 冰乙酸和 3 mL 酸性站 三酮显色液，于沸水浴中加热 40 min, 下步操作按标准曲线制作方法进行甲苯萃取和比色。
（3） 结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸含量. 按下式计算样品中脯氨酸含量的 百分数。
脯氨酸含量保 g - g7（干或鲜样）］=紡法
式中：刀一提取液中脯氨酸含量g~E_由标准曲线求得；
V—提取液总体积，mL；
A 一测定时所吸取的体积，mL；
W—样品重，g。
注意事项
1. 叶片萎薦时间一般 3〜4 h, 不能太久，否则脯氨酸积累多，样品测定需稀释。
2. 酸性曲三酮显色液与脯氨酸溶液现配现用效果好。
来源：丁香实验
