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        抗坏血酸过氧化物酶 (AsA-POD)活性的测定

        相关实验:抗坏血酸过氧化物酶 (AsA-POD)活性的测定

        最新修订时间:

        简介

        了解抗坏血酸过氧化物酶 (AsA-POD) 的作用。掌握分光光度法测定抗坏血酸过氧化物酶活性的方法。

        原理

        抗坏血酸过氧化物酶 (AsA-POD)活性的测定的基本原理是AsA-POD 催化 AsA 与 H2O2 反应,使 AsA 氧化成单脱氢抗坏血酸 (MDAsA)。 随着 AsA 被氧化,溶液中 290 nm 波长下的消光值 (A290) 下降,根据单位时间内A290减少值, 计算 AsA-POD 活性。AsA 氧化量按消光系数 2.8(mmol・L-1・cm-1) 计算,酶活性可用每克鲜重每小时氧化 AsA 的物质的量 (μmol ・g-1・h-1) 表示。

        材料与仪器

        材料:新鲜果实、蔬菜,植物根、茎、叶等。

        器材:离心机,紫外分光光度计,研钵,试管等。

        试剂:

        ①K2 HPO4-KH2PO4 缓冲液 (pH7. 0, 内含 0. 1 mmol ・ L-1 EDTA-Na2 )

        ②0. 3 mmol • L -1 AsA

        ③20 μmol • L -1 AsA

        ④0.06 mmol • L-1 H2O2

        步骤

        抗坏血酸过氧化物酶 (AsA-POD)活性的测定的基本过程可分为如下几步:

        1. 酶液制备:取 1.0 g 植物叶片剪碎,按 1 : 3(W/V) 加入预冷的 50 mmol・L1 K2 HPO4-KH2PO4 缓冲液进行研磨提取,用两层纱布过滤,滤液在 4 000 r • min'1 下离心 10 min, 上清液作酶粗提液供测定。


        2. 酶活性测定:3 mL 反应混合液中含 50 mmol • L-1, K2 HPO4-KH2PO4 缓冲液 (pH7.0),0.l mmol • L-1 EDTA-Na2, 0. 3 mmol • L-1 AsA, 0. 06 mmol • L-1 H2O2 和 0. 1 mL 酶液。加入 H2O2 后立即在 20°C 下测定 10〜30 s 内的 A290 变化,计算单位时间内 AsA 减少量及酶活性,以 1 min 内人 29。减少 0.01 的酶量为 1 个酶活单位 (U)。


        抗坏血酸过氧化物酶活力 [U・(g・ min)t] = WUoTl X t
        式中:AA290——反应时间内吸光度的变化;
        Vt—粗酶提取液总体积,mL;
        V1一测定用粗酶液体积,mL;
        FW—样品鲜重,g;
        0. 01—A290 每下降 0. 01 为 1 个酶活单位 (U);
        t 一反应时间,min。

        注意事项

        1. 酶液的提取过程要尽量在低温条件下进行。

        2.要在反应开始前加入,不能直接加入。

        来源:丁香实验

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