• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        使用增强剂改善高(G+C)含量DNA模板的PCR扩增

        相关实验:高(G+C)含量DNA的PCR扩增实验

        最新修订时间:

        简介

        许多有机化合物可以与 DNA 中的鸟瞟吟(G)和胞啥呢(C)碱基形成氢键,从而减少 DNA 分子内或分子间 G 和 C 形成的氢键,破坏由 G 和 C 间氢键形成的 DNA 分子二级或三级结 构。增强剂不仅可以提高 PCR 产物产量,而且对于提高 PCR 产物的专一性也有帮助,而在扩增 较长片段高(G + C)含量 DNA 模板时,增强剂更是必不可少。

        原理

        使用增强剂改善高(G + C)含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本原理是许多有机化合物可以与 DNA 中的鸟瞟吟(G)和胞啥呢(C)碱基形成氢键,从而减少 DNA 分子内或分子间 G 和 C 形成的氢键,破坏由 G 和 C 间氢键形成的 DNA 分子二级或三级结构。增强剂不仅可以提高 PCR 产物产量,而且对于提高 PCR 产物的专一性也有帮助,而在扩增较长片段高(G + C)含量 DNA 模板时,增强剂更是必不可少。至今已有许多增强剂应用于高(G + C)含量 PCR 扩增,包括 DMSO (二甲亚碉)、甲酰胺、甘油、甜菜碱(betaine)、聚乙二 醇(polyethylene glycol, PEG)、7-脱氮-脱氧鸟嗦吟核昔三磷酸(7-deaza dGTP)、脱氧肌昔 (deoxyinosine)以及其它小分子酰胺类(amides)、砚类(sulfones)和亚砚类(sulfoxide)等有机试剂。

        材料与仪器

        器材:

        ToboCycler® Gradient 96 thermal cycler (Stratagene, La Jolla, CA, USA),电泳仪。

        试剂:

        ① dNTP 和 Taq DNA 聚合酶(Stratagene 公司)

        ② 四亚甲基亚碉 [tetramethylene sulfox¬ide Acros Organics (USA)公司

        ③ 人骨髓白细胞 mRNA (Clontech)

        ④ RT-PCR 试剂盒(Strata¬gene 公司)

        ⑤ 琼脂糖(Promega 公司)

        ⑥ TAE 电泳缓冲液

        ⑦ Tris、HC1、KC1、MgCl2,明胶等为分析纯

        步骤

        使用增强剂改善高(G + C)含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本过程可分为如下几步,以人骨髓白细胞 mRNA 为例:

        A 引物设计根据人骨髓白细胞 ojzm 基因序列设计上下游引物:

        c-jun 1:5'-ATGACTGCAAAGATGGAAACG;

        c-jun 2:5'-TCAAAATGTTTGCAACTGCTGCG

        B 模板制备人骨髓白细胞 ojun cDNA,全长 996 bp,用 RT-PCR 试剂盒(Stratagene 公司)从人骨髓白细胞 mRNA(Clontech)反转录获得。

        C 反应体系将下列各种成分加至 200』薄壁管:10 mmol/L Tris-HCl(pH8.8),50 mmol/L KC1,1.5 mmol/L MgCl2,0.1 g/L 明胶,0.2 μmol/L 引物,0.2 mmol/L dNTP,0.06 ng/μL 模板,0.5 mol/L 四亚甲基亚砚。按 0.04U/μL 加 DNA 聚合酶(模板变性后添加),用水补足至总体积 50 μL。

        D 反应条件将薄壁管放入 PCR 仪,升温至 95 ℃ 保持 5 min,以使模板 DNA 完全变性;降温至 54 ℃ 保持 5 min,在此期间按 0.04 U/Ml 添加 Tag DNA 聚合酶;按(95 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min)进行 30 个循环反应;最后,72 ℃ 延伸 5 min。

        E PCR 产物检测用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 反应产物。

        注意事项

        1因不同增强剂对不同模板效果有所差异,用PCR扩增其它高(G+C)含量DNA模板时,如果没有PCR产物,可尝试使用本节所列其它增强剂。

        2 PCR循环反应前,先 95 ℃ 变性5 min,一般可以将包括基因组DNA在内的大多数复杂DNA变性,在加四亚甲基亚碉作为变性剂时,变性温度甚至可以降到 92 ℃。

        3 Taq DNA聚合酶对高温相对敏感,模板变性后添加Tag DNA聚合酶有利于保护酶的活性。若用Pfu DNA聚合酶,对高温稳定一些。

        4 PCR循环扩增时,95℃变性1 min可以使非常复杂的模板变性;若以质粒克隆片段作模板,变性时间甚至可以缩短到30 s。退火温度可根据模板和引物复杂程度,作适当的调整,一般在50〜70℃之间,时间也可以缩短到30 s;延伸温度与使用的DNA聚合酶有关,常见的Pfu、Vent等为72℃,而用Roche公司的Expand Long Template PCR System中DNA聚合酶延伸温度为68℃;延伸时间与模板长度和使用酶的效率有关,可参考相关商品酶使用说明书。

        常见问题

        1 因不同增强剂对不同模板效果有所差异,用 PCR 扩增其它高(G + C)含量 DNA 模板 时,如果没有 PCR 产物,可尝试使用本节所列其它增强剂。

        2 PCR 循环反应前,先 95 ℃ 变性 5 min, 一般可以将包括基因组 DNA 在内的大多数复杂 DNA 变性,在加四亚甲基亚碉作为变性剂时,变性温度甚至可以降到 92 ℃。

        3 Taq DNA 聚合酶对高温相对敏感,模板变性后添加 Tag DNA 聚合酶有利于保护酶的活 性。若用 Pfu DNA 聚合酶,对高温稳定一些。

        4 PCR 循环扩增时,95 ℃ 变性 1 min 可以使非常复杂的模板变性;若以质粒克隆片段作模板,变性时间甚至可以缩短到 30 s。退火温度可根据模板和引物复杂程度,作适当的调整,一般在 50〜70 ℃ 之间,时间也可以缩短到 30 s;延伸温度与使用的 DNA 聚合酶有关,常见的 Pfu、Vent 等为 72 ℃ ,而用 Roche 公司的 Expand Long Template PCR System 中 DNA 聚合酶延伸温度为 68 ℃;延伸时间与模板长度和使用酶的效率有关,可参考相关商品酶使用说明书。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序