• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        肝微粒体制备

        相关实验:肝微粒体制备

        最新修订时间:

        简介

        肝微粒体制备,是由肝组织勾浆经超速离心得到的内质网碎片形成的小泡,适各代谢酶催化的生物转化反应和抑制研究。通过向孵育体系中添加不同的辅因子,研究体外代谢实验。

        原理

        肝微粒体制备的基本原理是通过向孵育体系中添加不同的辅因子,研究或区分细胞色素 P450(CYP)、黄素单加氧酶(FMO)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)等体外代谢实验。

        用途

        肝微粒体制备可用于研究研究体外代谢。

        材料与仪器

        器材:


        ① 内切式匀浆机、高速离心机、超速离心机


        ② 表面皿数个、冰袋数个


        ③ 碎冰


        ④ 烧杯、匀浆用玻璃管


        ⑤ 不锈钢剪刀、(双光束) 紫外分光光度计、CO 通气设备


        试剂:

        ① 0.15 mol/L KCI 的 100 mmol/L 磷酸钾缓冲液 (pH 7.4)


        ② 10 mmol/L 磷酸钾级冲液 (pH 7.4)


        ③ 2% 碳酸钠溶液 (用 0.1 mol/L NaOH 配制)


        ④ 0.5% 硫酸铜 (用 1% 酒石酸钾配制)


        ⑤ 牛血清白蛋白 (BSA) 标准液 500 ug/ml(用 0.1 mol/L NaOH 配制)


        ⑥ 酚试剂:连二亚硫酸钠溶液 (0.1 g/ml)

        步骤

        肝微粒体制备的实验步骤如下:

        A、组织用含 0.15 mol/L KCI 的 100 mmol/L 磷酸钾缓冲液 (pH 7.4) 内切式匀浆机匀浆。

        B、9000×g 离心 20分钟,取上清。

        C、超速离心机 105000×g 超速离心 60 分钟。

        D、取沉淀重悬于 100 mmo/L 磷酸钾缓冲液 (pH 7.4) 中,105000×g 超速离心 60 分钟,取沉淀,即微粒体。

        E、将人肝微粒体中底部的油状物质与上层的蛋白质分开储存。

        F、将微粒体重悬于少量磷酸钾缓冲液 (pH 7.4,100 mmol/L) 中。

        G、临用时取 2% 碳酸钠溶液 50 ml,加 0.5% 硫酸铜 1 ml,混匀(甲液),放 50 ℃ 水浴 10 分钟 (或室温 30 分钟),冷却后,680 mm 比色,计算每 1 ml 中蛋白含量,将各管微粒体贮存液稀释成等浓度蛋白悬液(测定管和标准管均平行做两),建立蛋白浓度标准曲线。

        H、微粒体悬液在 0.1 mo/L 磷酸缓冲液 (pH7.4) 中稀释至 0.5 mg/ml 各取 3 ml 加人两比色杯中,紫外分光光度计 500~400 nm 波长区间扫描并做基线校正,各杯中加入连二亚硫酸钠溶液 (0.1 g/ml)20 ul。

        I、迅速向测定管内充 CO 30~60 秒 (充气速度要慢,防止起泡沫),稳定 5 分钟后,在 500~400 nm 波长区间再次进行扫描测定,得到还原型细胞色素 P450 的吸光度 (OD) 值。

        J、计算细胞色素 P450 含量。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序