家兔体细胞核移植技术

家兔跟人类有相似的生物化学和生理过程，是研究人类繁殖、心血管疾病和再生生物学的理想模式动物。在20世纪80-90年代，已能通过细胞核移植将胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中，并生产出克隆家兔。

研究发现以分化的体细胞作为核移植的供核细胞，家兔相对其他物种更加难以产生克隆动物，这可能是因为家兔植入前胚胎的细胞周期较短和其他未知的核重编程机制造成的，家兔的克隆胚胎在胚胎植入期和妊娠期表现出较高的流产率。

迄今为止，只有少数几例成功获得体细胞核移植家兔的报道。

体细胞核移植的原理是：来源于同一胚胎的所有细胞核都含有与受精卵完全相同的遗传信息，从基因组成上具有与受精卵一样的指导个体发育的全部潜能。

然而，随着胚胎的发育与细胞的分化，细胞核的某些基因组发生了变化，导致这些基因组不能恢复到从前的状态，从而丧失了核的全能性。

但是他们包含着生物体的全部遗传信息，并在特定环境因素的调节下，可恢复受精卵一样的状态，并从头开始发育成一个完整的生物个体。

家兔体细胞核移植技术的基本过程可分为如下几步：

一．超数排卵与卵母细胞的采集

1.性成熟的新西兰雌性白兔（6～18月龄）被用作胚胎供体，在光照条件为16：8（光照：黑暗）小时的环境清洁动物室内饲养。

2.供体兔经超数排卵处理，处理方法是连续3天，每天两次肌内注射0.3 mg，0.4 mg，0.5 mg促卵泡激素（FSH）。处理完FSH 12小时后，肌内注射200 U人绒毛膜促性腺激素（hCG）。

3.超数排卵处理的母兔不与公兔交配，作为细胞核移植的卵母细胞的供体；超数排卵处理的母兔与公兔合笼交配，作为胚胎的细胞核供体。

Dutch Belted母兔通过注射GnRH（每只15 μg），作发情同步化处理（比供体晚22小时），作为重构胚胎移植的受体兔。受体兔在胚胎移植后送入光照条件为8：16（光照：黑暗）小时的环境清洁动物室内饲养。

4.注射hCG 10-12小时后，供体兔从腹中线开口，外科手术方法剪取输卵管与卵巢，用5 ml冲卵液从输卵管的壶腹部向喇叭口冲卵母细胞。

5.卵丘细胞-卵的复合体（COC）用PBS＋0.5 mg／ml的透明质酸酶处理1分钟，用口吸管将卵丘细胞轻轻地从卵母细胞透明带上吹离，在光学显微镜下检查卵母细胞极体的排出情况，决定卵母细胞是否处于MII期。

6.卵母细胞也可以从卵巢的滤泡中用细小的针尖挑破，释放出卵母细胞。在卵巢上收集的COC，用输卵管卵母细胞同样的方法，去除卵丘细胞。经鉴定显示有极体的卵母细胞，可用于细胞核移植实验。

二．供核细胞制备

（1）颗粒细胞作为供核细胞：从COC上吹离的卵丘细胞可直接作为细胞核移植的供核细胞，收集的颗粒细胞先在无Ca₂和Mg₂的D-PBS＋10％ PVP-40中清洗。

添加PVP-40有助于去除膜损伤的颗粒细胞，1000 r／min离心收集细胞，将细胞用0.05％ 的胰酶＋0.5 mmol／L EDTA中37 ℃消化3分钟，处理的卵丘细胞悬浮于DMEM＋10％ FBS中，37 ℃中存放，待细胞核移植使用。

（2）rhES作为供核细胞：将rhES按照前述的方法复苏，在DMEM中清洗1次，悬浮于PBS＋15％ FBS，37 ℃中存放，待细胞核移植使用。

（3）胚胎细胞作为供核细胞：将受精卵在体外培养后，发育成8～16细胞期或32～64细胞期后，用pH2.3的D-PBS去除透明带，然后裸露的胚胎在pmnaseE的溶液中分散成单个胚胎细胞，悬浮于PBS＋15％ FBS．37 ℃中存放，待细胞核移植使用。

三．核移植操作

2.处理的卵母细胞用10 μg／ml的Hoechest 33342染色，在紫外线的照射下检查是否去核成功。

3.直接注射的方法进行移核：用10％ PVP-360清洗过的移核针（8 μm的内径），机械方法使供核细胞裂解。用Poezo-Drill系统将细胞膜被部分破坏的供核细胞注射入去核卵母细胞的胞质内，在400倍放大镜下检查是否成功移核。

细胞融合的方法移核：直径大约20μm的供核细胞用移核针（25μm的内径）转移到去核卵母细胞的透明带下（图4-7-1e）。“核-质体”在细胞融合液中孵育3分钟。

然后移入含融合液的融合小室内，用细胞融合仪（BTX 200）施加3个直流脉冲，脉冲强度3.2 kV／cm。电击后“核-质体”在38.5℃孵育至少15分钟、在显微镜下检查细胞融合情况。

4.注射的或融合的卵母细胞在M199＋10％ FBS中孵育1小时后，然后进行孤雌激活。用直流电刺激使克隆重构胚激活（其方法跟细胞融合的方法相同），激活后胚胎在M199＋10％ FBS＋2 mmol／L 6-dimethylaminopurine＋5 μg／ml cyeloheximide孵育1小时。

四．兔克隆胚体外发育

2.克隆胚胎也可以继续体外培养4天后，发育成囊胚，检查胚胎发育的细胞数。

bES细胞经过胰蛋白酶化处理成单个细胞后，被转移到去核的兔卵母细胞中，经细胞融合形成重构胚。重构胚经过电化学激活后，在体外培养5天后发育到囊胚期。

五．兔克隆胚体内发育

2.在移植后14-16天，通过腹部触诊检查妊娠。受体妊娠31～33天妊娠到期，经自然分娩获得克隆死胎或剖宫产手术获得克隆活崽。